Общие принципы аллергологического метода исследования. Аллергологические исследования Аллергологический метод исследования в микробиологии

Капельная проба.

Для постановки кожных капельных проб применяются водные растворы веществ. Обычно употребляются невысокие концентрации аллергенов, например, 0,25% раствор новокаина, 50000 пенициллина. Каплю раствора аллергена наносят на неповрежденную кожу (волярную поверхность) предплечья, живота. Параллельно ставят контрольную капельную пробу с растворителем (физиологическим раствором или дистиллированной водой).

Результаты капельной пробы регистрируются через 20 минут и спустя сутки с момента нанесения испытуемого раствора лекарственного вещества. Если в месте нанесения лекарства есть гиперемия, отек, то реакция положительная, данный препарат назначать нельзя.

Аппликационная кожная проба.

Аппликационные кожные пробы делают на волярной поверхности предплечья, на животе, спине. При этом на кожу накладывают марлю размером 2х2 см, смоченную раствором исследуемого лекарственного вещества. Сверху марли накладывают компрессную бумагу или целлофан, затем наклеивают кусок лейкопластыря 4х4 см. Аналогичным образом делают и с контрольным растворителем (физ.раствором).

Результаты оцениваются через 24-72 часа следующим образом: гиперемия (+); гиперемия, отечность, образование папул (++); яркая эритема, отечность, папулы, везикулы (+++); образование крупных пузырей и некроза (++++). Лейкопластырь в местах непосредственного контакта с кожей, как правило, вызывает раздражение кожи (непосредственная реакция-гиперемия, отек), поэтому оценивать нужно только участок кожи, непосредственно соприкасающийся с марлей, смоченной раствором лекарственного препарата.

В случае резкого нарастания аллергической реакции (появление зуда, чувства жжения и т.д.) пробу следует быстро снять и обмыть кожные покровы, и данное лекарство не назначать.

Скарификационная кожная проба.

Перед постановкой этой пробы - кожу (спины, живота или внутренней поверхности предплечья) следует обработать спиртом. Затем на расстоянии 5 см друг от друга наносят каплю 0,01% раствора гистамина (положительный контроль), каплю испытуемого лекарственного аллергена и каплю разводящей жидкости - физиологического раствора (отрицательный контроль). Стерильными иглами или скарификаторами наносят две поверхностные скарификации (не кровоточащие) в длину до 5-10 мм, на расстоянии 3 мм друг от друга. Реакцию оценивают через 20 минут, промокая капли аллергена отдельными ватными тампонами. Надо смотреть и через 24 часа (могут быть замедленные реакции).

Если на месте скарификации развивается гиперемия, а при натягивании кожи отек (побеление) в месте царапин, реакция слабоположительная (+).

Если волдырь с гиперемией в месте царапин виден на глаз, а при натягивании отек увеличивается, то реакция положительная (++).

Волдырь диаметром 10 мм с гиперемией и ложноножками свидетельствует о резко положительной реакции (+++).

Волдырь размером более 10 мм в диаметре с псевдоподиями и гиперемией показывает о реакции положительной в очень резкой степени (++++).

Провокационная подъязычная проба.

Перед проведением пробы осмотреть подъязычную область. Больному под язык дается 1/4 разовой терапевтической дозы испытуемого лекарственного препарата. При положительной пробе через 10-20 минут у больного появляется отек уздечки языка, отек губ, кожный зуд; единичные или распространенные уртикарные высыпания. При этом больной должен немедленно удалить оставшуюся часть препарата, прополоскать рот, не глотая жидкости, и принять антигистаминные.

Провокационная проба.

Пероральная:

Больному дается 1/4 разовой терапевтической дозы испытуемого лекарственного препарата. При положительной пробе в течение ближайших 2 часов могут появиться удушье, единичные волдырные элементы, повышение температуры. При этом больному дается солевое слабительное и назначаются антигистаминные препараты.

Парентеральная:

Четверть разовой дозы вводится внутримышечно в область бедра, если препарат вводится внутримышечно; п/к - в область предплечья, если препарат вводится подкожно и оценивается через 20 минут. При отрицательном результате через два часа вводится разовая доза. При проведении пробы с препаратом для внутривенного введения готовится раствор для внутривенного капельного введения и вводится медленно 10-20 капель в минуту в течении 2-5 минут. При отсутствии общих клинических симптомов и изменений гемодинамики введение лекарственного вещества продолжается.

Провокационные пробы проводятся врачом под контролем гемодинамики.

Тест торможения естественной эмиграции лейкоцитов in vivo для специфической диагностики лекарственной аллергии (ТТЭЛ)

Для ТТЭЛ необходимы:
Оборудование: (на одно исследование)

1. 4 химических стаканчика емкостью 50 мл.

2. 5 пробирок емкостью 20 мл.

3. Штатив для пробирок (1).

4. 2 пипетки (1,0 и 10,0 мл.).

5. Микропипетки (2).

6. Счетная камера Горяева (1).

7. Часовое стекло (1).

8. Микроскоп бинокулярный (об.20, ок.7)

Реактивы:

1. Физиологический раствор рН 7,3-7,4 (рН раствора устанавливается добавлением 0,1 М NаОН при помощи потенциометра ПП-0,1).

2. 0,01% раствор красителя генцианового фиолетового в 3% уксусной кислоте.

Медикаменты:

Для исследования используются водорастворимые формы медикаментов в следующих концентрациях:

1. Пенициллин - 1 мк/мл.

2. Цефалоспорины (цефазолин, кофзол, цефамизин)-1 мкг/мл.

3. Аминогликозиды (стрептомицин, канамицин, гентамицин)-10 мкг/мл.

4. Макролиды (эритромицин)-10 мкг/мл.

5. Хлорамфеникол (левомицетин) -10 мкг/мл.

6. Тетрациклины -10мкг/мл.

7. Сульфаниламидные препараты-100 мкг/мл.

8. Производные пиразолона и ацетилсалициловой кислоты-100 мкг/мл.

9. Местные анестетики (новокаин, лидокаин, тримекаин)-100 мкг/мл.

10. Антибиотики других химических групп - 10 мкг/мл.

Если у больного в анамнезе отмечались анафилактические реакции на введение медикаментов, то независимо от названия лекарственного препарата исследования начинают с концентрации препарата 1 мкг/мл. В случае отрицательного результата тест повторяют с этим же медикаментом в дозе 10 мкг/мл, а если необходимо - то с дозой 100 мкг/мл.

В один день можно проводить только одно исследование с одним препаратом и с одной его концентрацией. Во время проведения теста запрещается принимать пищу, пить, курить, принимать лекарственные препараты. Тест проводится в процедурном кабинете.

До и после постановки ТТЭЛ in vivo врач тщательно осматривает больного, измеряет АД, ЧСС, частоту дыхания.

Обследование рассчитано на 1,5 часа и состоит из двух этапов.

I-й этап:

Подготовка материала к исследованию:

1. Через час после еды больной тщательно прополаскивает полость рта кипяченой водой для механической очистки ее в течении 2-х минут.

2. Спустя 30 минут после первого полоскания следует прополоскать передний отрезок полости рта 10 мл физиологического раствора (рН 7,3-7,4) в течение 2-х минут.

3. Жидкость из полости рта (промывные воды) собирают в стаканчик №1, как исходную порцию (контроль).

4. Через 15 минут производится полоскание полости рта в течение 2-х минут физиологическим раствором с разведенной в нем исходной концентрацией испытуемого медикамента. Эта порция промывной жидкости собирается в стаканчик №2 и в дальнейшей работе не используется.

5. Еще через 15 минут вновь ополаскивают передний отрезок полости рта в течение 2-х минут 10 мл физиологического раствора (рН 7,3-7,4) и промывную жидкость собирают в стаканчик №3.

6. После этого через 15 минут передний отрезок полости рта ополаскивают в течение 2-х минут 10 мл физиологического раствора (рН 7,3-7,4) и собирают промывную жидкость в стаканчик №4.

II-й этап:

Окраска и подсчет лейкоцитов в собранном материале. Приготовление и просмотр окрашенных мазков.

1. Промывную жидкость из полости рта в стаканчике №1 (контрольная порция) после получения тотчас тщательно перемешивают микропипеткой и в количестве 0,2 мл помещают на часовое стекло.

2. Туда же добавляют 0,04 мл раствора красителя генцианового фиолетового.

3. Через 5 минут исследуемую смесь помещают под притертое стекло камеры Горяева.

4. Подсчет лейкоцитов проводиться в 100 больших квадратах камеры Горяева и рассчитывает количество лейкоцитов в 1 кубическом мм.

Таким же образом подсчитывают количество лейкоцитов в стаканчиках № 3 и 4 (опытные порции)

Индекс эмиграции лейкоцитов в полости рта рассчитывают по формуле:

где Нк-количество лейкоцитов (нейтрофилов) в первой, исходной порции, Но-количество лейкоцитов (нейтрофилов) в опытных стаканчиках №3 и 4.

Тест оценивается как положительный при снижении числа клеток по индексу эмиграции более, чем на 30%.

Приложение №5 .

7039 0

Эти методы могут широко использоваться при аллергических заболеваниях в фазе обострения, в периоды массивного контакта с аллергеном, при высокой чувствительности заболевших к аллергену, при наличии противопоказаний, у детей, при идентификации профессиональных аллергических заболеваний, так как исключают возможность появления неспецифических, ложноаллергических реакций.

Среди различных способов специфической аллергодиагностики при реагиновом IgE-зависимом типе более предпочтительно определение моноклональных IgE.

Существуют непрямые методы определения IgE и наиболее распространенные прямые методы выявления специфических IgE, основанные на новых технологиях и использовании диагностикумов в виде стандартизованных и сертифицированных аллергенов к ним.

Реакция пассивного переноса по Праустнитцу—Кюстнеру (непрямой метод постановки кожной пробы) чаще используется в детской практике при идентификации пищевой аллергии. Сущность метода заключается в реакции пассивного переноса реципиенту сенсибилизации с помощью внутрикожного введения 0,1 мл сыворотки крови больного с наличием в ней предполагаемых специфических IgE. Спустя 24 ч в этот же участок вводят 0,02 мл предполагаемого аллергена. Реакцию регистрируют через 20 мин. Однако угроза переноса СПИДа, вирусного гепатита и других инфекций не позволяет широко использовать данный метод.

Определение специфических IgE

Метод RAST наиболее специфичен и точен, так как основан на использовании радиоактивной метки. Сущность его заключается в связи специфического IgE исследуемой сыворотки с аллергеном, размешенным на бумажной пластинке. После отмывания неспецифического (общего) IgE в содержимое добавляются меченые 125I антитела против IgE. Образовавшийся радиоактивный комплекс считывается на сцинтилляционном счетчике.

Метод ИФА

При точечном иммуноанализе аллергены наносятся в виде точек на нитроцеллюлозные диски.

Для определения концентрации специфических IgE, связанных с аллергеном, добавляются антиантитела (меченные ферментом) к IgE. На следующем этапе с помощью специальных реагентов, воспроизводящих цветную реакцию, интенсивность которой зависит от концентрации специфических lgЕ в комплексе с аллергеном, определяют содержание специфических lgЕ фотометрически в вертикальном луче в системе «Унискан» или «Мультискан». В норме она не превышает 210 МЕ/ед.

Наряду с выявлением специфических lgЕ используются и другие лабораторные тесты для диагностики как антителозависимых реакций (определение показателей специфического повреждения базофилов, аллергических антител в реакции пассивной гемагглютинации, реакция связывания комплемента и др.), так и реакций замедленного (клеточного) типа (реакция торможения миграции лейкоцитов крови — РТМЛ, тест розеткообразующих клеток — РОК, тест повреждения нейтрофилов и др.).

Их применение в аллергологической практике не потеряло своего значения — идентификация повышенной чувствительности к аллергенам, аутоантигенам позволяет осуществлять более целенаправленное лечение и реабилитацию больных.

Реакция прямого специфического повреждения базофилов крови

Для постановки реакции 5 мл исследуемой крови добавляют в центрифужную пробирку с 5 каплями 6 % водного раствора трилона Б и инкубируют в течение часа при 37 °С. Образовавшуюся взвесь лейкоцитов с помощью пастеровской пипетки переносят в чистую пробирку, а затем разливают в две центрифужные пробирки по 0,3 мл. В первую пробирку (опытную) добавляют 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия, в котором растворена рабочая доза аллергена, во вторую (контрольную) — 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия без аллергена.

Обе пробирки инкубируют в течение 10 мин при 37 °С, затем центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин. После чего сливают надосадочную жидкость, а лейкоцитарную массу, оставшуюся на дне пробирки, осторожно встряхивая, разбивают в остатке жидкости, стекающей со стенок. С помощью пастеровской пипетки содержимое каждой пробирки переносят на отдельные предметные стекла (в виде капли на край) и шлифованным краем другого стекла готовят тонкие лейкоцитарные мазки.

Мазки окрашивают эозин-метиленовым синим по Май—Грюнвальду в течение 1—2 мин после просушивания на воздухе. После промывания препарата в метиловом спирте мазки-препараты микроскопируют с иммерсией (увеличение 10 х 80). Просчитывают 50 базофилов по краям мазка и число поврежденных средних клеток. Показатель поврежденных клеток в опытном и контрольных препаратах определяют по формуле:

Л.А. Дуева с соавт. (1986) подобрали рабочие концентрации и дозы химических аллергенов и антибиотиков для реакции прямого специфического повреждения базофилов крови (табл. 4).

Таблца 4. Рабочие концентрации и дозы реагентов для РСПБ

Тест деструкции тучных клеток

Суспензию тучных клеток (0,02 мл) и сыворотку больного (0,02 мл) инкубируют 15 мин при 37 °С, затем вносят 0,02 мл аллергена в предварительно подобранной концентрации и снова инкубируют 15 мин при 37 °С. Одномоментно готовят три контроля: тучные клетки без сыворотки и без аллергена; тучные клетки с сывороткой без аллергена; тучные клетки с аллергеном без сыворотки.

После окраски образцов 0,025 % раствором толуидинового синего или 0,3 % раствором нейтральной краски заполняют суспензией тучных клеток камеры Горяева и подсчитывают окрашенные клетки, сравнивая число гранулированных клеток в контроле и опыте. Наблюдаемая дегрануляция тучных клеток в испытуемом образце считается слабоположительной при наличии 10—20 % дегрануляции, положительной — при 21—40 %, резкоположительной — при дегрануляции более 40 % клеток по сравнению с контролем.

Концентрация аллергенов, не вызывающая спонтанной дегрануляции, для антибиотиков — 100—1000 ЕД/мл, калия бихромата и йодида, натрия хромата, никеля сульфата — 0,01—0,1 % раствора, формальдегида — 0,2—0,4 %. Бытовые аллергены используются в дозе от 10 до 100 PNU.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) позволяет обнаруживать антитела к водорастворимым и водонерастворимым аллергенам.

Реакция основана на феномене агглютинации эритроцитов, сенсибилизированных in vitro к химическим аллергенам, при добавлении сыворотки пациента, содержащей антигаптенные антитела.

Реакция торможения миграции лейкоцитов крови (РТМЛ) основана на способности сенсибилизированных Т-лимфоцитов (например, к гаптенам) выделять лимфокин — фактор, ингибирующий миграцию лейкоцитов. С помощью РТМЛ раскрывается реакция клеточного типа (неантителозависимая) к различным антигенам.

• анамнез, осмотр, аускультация, осмотр ЛОР-органов;
• кожные пробы (прик - тест, скарификации) с широким спектром аллергенов;
• провокационные пробы (назальный, конъюнктивальный и ингаля-ционный);
• иммунологическое обследование скрининговое;
• исследование интерферонового статуса;
• скрининговое аллергологическое обследование (определение методом ИФА уровня специфических IgE, IgG антител к бытовым, эпидер-мальным, пищевым, пыльцевым аллергенам);
• исследование функции внешнего дыхания (ФВД);
• общие анализы крови, мокроты, цитология назального секрета - по показаниям.

Первичная консультация врача аллерголога - иммунолога начинается с опроса пациента. При диагностике аллергии необходимо выяснить у пациента, когда впервые появились симптомы заболевания, условия их возникновения и развития, в каких случаях аллергическая реакция выражается максимально, условия быта и работы, наличие животных, имеются ли аллергические заболевания у родственников и т.д.

Следующий этап - диагностики аллергических заболеваний постановка кожных проб (прик - тест, скарификации) с пыльцевыми, бытовыми, эпидермальными, пищевыми аллергенами.

При проведении кожных тестов на кожу наносятся или внутрикожно вводятся определенные аллергены. По реакции на них (покраснение, появление аллергической реакции в месте нанесения/введения аллергена) судят о наличии аллергии.

Для выявления скрытого бронхоспазма проводится исследование функции внешнего дыхания (ФВД).

Пациентам с частыми простудами, обострениями хронических заболеваний, герпесом, аллергическими заболеваниями, с хронической ЛОР-патологией, длительным субфебрилитетом, иммунодефицитными состояниями и пр. проводится исследование иммунного (определение состояния иммунной системы) и интерферонового статуса.

Что такое иммунограмма

Иммунограмма - это исследование основных показателей иммунной системы человека. Обычно определяются основные параметры иммунной защиты человека: количество и функциональная способность (например фагоцитарные индексы) лейкоцитов, их процентное соотношение; клеточный иммунитет - общее количество Т-лимфоцитов и их популяции; гуморальный иммунитет - уровень иммуноглобулинов (антител) классов А, М, G, Е и количество В - лимофоцитов; определение показателей системы комплимента и интерферона.

После обнаружения аллергена, установления причины заболевания назначается лечение. В настоящее время разработано огромное количество способов иммуно-аллергологического обследования пациентов, включающих самые современные методы диагностики аллергии. Врач аллерголог-иммунолог в каждом конкретном случае составляет индивидуальный план обследования. Ведьправильный диагноз и составление плана лечения возможно только после комплексного обследования.

По статистике ВОЗ, аллергия имеется у 40% населения. И это объяснимо: воздух, вода и почва планеты перенасыщены вредными веществами, пища давно перестала быть чистой и простой по составу, применение химии в быту превысило все разумные пределы.

С каждым днем у аллергологов и иммунологов появляется все больше пациентов. Немаловажное значение при этом имеет наследственный фактор: доказано, что дети аллергиков имеют 70%-ный шанс стать аллергиками, если этим недугом страдают оба родителя, если же только отец или мать - вероятность снижается до 33%, что тоже немало.

Как возникает аллергическая реакция

Это повышенная чувствительность организма к определенному веществу, будь то лекарство, продукт, шерсть, бытовая пыль, цветочная пыльца, плесень или микроб.

Большинство людей никак не реагируют на то, что заставляет аллергика заливаться слезами, кашлять и покрываться сыпью. Иммунная же система больного дает на этот возбудитель () специфический ответ.

В норме задача производимых иммунной системой антител (иммуноглобулинов) - противодействие болезнетворным микроорганизмам и вредоносным веществам. Однако стоит произойти сбою (причина которого зачастую доподлинно не известна), и эти антитела, не распознав «своих» и «чужих», запускают аллергическую реакцию на самые безобидные вещества. А благодаря механизмам «запоминания», в следующий раз, при повторном попадании этого компонента в организм, иммунитет выдает усиленный ответ, который проявляется полным набором выраженных аллергических симптомов.

Что такое аллергены

По своей природе аллергены - это чужеродные белки и липиды, а также полисахариды животного и растительного происхождения.

В организм человека антигены могут проникнуть несколькими путями:

• Через кровь (например, ужалило насекомое или сделана инъекция и последовала аллергическая реакция на введенное вещество).
• Посредством вдыхания (в воздухе присутствовали аллергены).
• Энтерально (аллерген поступил с пищей, водой).
• Через кожу и слизистые оболочки.

Классификация аллергенов

Существует несколько классификаций аллергенов, одна из самых распространенных основана именно на способе попадания аллергена в организм:

А. Ингаляционные аллергены:

1. Бытовые аллергены:
   • бытовая и производственная пыль;
   • споры дрожжеподобных и плесневых грибов;
   • клещи домашней пыли, корм для рыб.
2. Эпидермальные аллергены:
   • эпидермис, частицы эпидермиса, перхоть, волосы человека;
   • шерсть, секреты животных (слюна, моча, выделения сальных и потовых желез).
3. Пыльцевые аллергены (пыльца растений):
   • деревьев (березы, дуба и др.);
   • злаковых культур;
   • сорных трав (амброзии, полыни обыкновенной, подсолнечника);
   • луговых трав (овсяницы луговой, ежи, мятлика).
4. Частицы тел насекомых.

Б. Энтеральные аллергены

• Пищевые аллергены растительного происхождения (цитрусовые, орехи, кунжут, бобовые, злаки, томаты и др.);
• Пищевые аллергены животного происхождения (рыба, молоко, яйца, морепродукты и др.).

В. Лекарственные препараты.

Г. Инсектные аллергены:

• яды перепончатокрылых насекомых (пчел, ос, шмелей, шершней, оводов, слепней и др.);
• слюна кровососущих насекомых (комаров, клопов, мошки и др.).

Симптомы аллергии

Хотя аллергия отличается многообразием проявлений, все же можно выделить типичные ее признаки, такие как:

• насморк, заложенность носа, чихание, отек слизистой;
• слезотечение, покраснение глаз, воспаление конъюнктивы, мутные выделения;
• затруднение дыхания, одышка, бронхиальный спазм, хрипы и др.;
• покраснение кожи, сыпь, зуд, шелушение;
• тошнота, рвота, диарея;
• головная боль.

Более подробную информацию о симптомах аллергологических заболеваний можно найти на нижеследующих страницах сайта:

Из чего состоит аллергологическое обследование

После сбора анамнеза направляет пациента на необходимые исследования.

В борьбе с аллергией роль диагностики первостепенна, ведь определение аллергена, вызвавшего патологическую реакцию иммунной системы, - залог того, что лечение принесет желаемые плоды.

Возможно двумя методами:

• кожные пробы;
• лабораторные тесты.

Кожные пробы

На чувствительную кожу внутренней стороны предплечья одноразовым инструментом наносятся царапины (скарификационный тест) или делаются неглубокие уколы (прик-тестирование). Далее исследуется реакция поврежденного участка на самые распространенные аллергены, которые наносятся капельно. Покраснение, отек, иной видимый отклик кожи сигнализирует о наличии аллергии на определенное вещество.

Важно! Кожные пробы проводят в период ремиссии заболевания во избежание искажения результатов.

Иногда кожные пробы оказываются не показательными или ложноположительными - например, у пациента выявилась повышенная чувствительность капилляров кожи к механическому раздражению или аллергия на консервирующие компоненты раствора с аллергенами.

Лабораторные исследования

В ходе этих тестов исследуется сыворотка крови или цельная кровь.

Определение аллергоспецифических lgE:

• RAST (радиоаллергосорбентная проба). С ее помощью устанавливается наличие антител нескольких классов: IgE, IgM, IgG.
• ИФА (иммуноферментный анализ) также дает возможность определить присутствие и активность иммуноглобулинов E, G, M.
• РПГА, пассивная гемагглютинация.
• РТМЛ, торможение движения лейкоцитов.

Аллергологическая диагностика в клинике «МедикСити»

В нашей клинике вы можете пройти , включающее все самые современные методы диагностики.

Аллергологическое обследование:

• Общий IgE и ECP;
• Общий IgE и ECP;
• Иммуноглобулин Е;
• Эозинофильный катионный белок;
• Микроскопическое исследование на эозинофилы.

Профессиональные аллергены, определение специфических IgE:

• Латекс;
• Формальдегид/формалин.

Определение специфических IgG:

• Скрининг ингаляционных аллергенов, определение специфических IgE;
• Скрининг бытовых аллергенов - домашняя пыль (D. pteronyssimus, D. farinae, таракан);
• Скрининг аллергенов постельного пера (перо гуся, перо курицы, перо утки, перо индюка);
• Скрининг аллергенов микроскопических грибов (Aspergillus fumigatus, Alternaria tenuis, Cladosporium herbarum, Penicillium notatum, Candida albicans);
• Скрининг аллергенов смеси перьев птиц (перо волнистого попугая / Melopsittacus undulates, перо попугая / Psittacidae spp., перо канарейки / Serinus canaries);
• Скрининг аллергенов трав №1 (ежа сборная, овсяница луговая, рожь многолетняя, тимофеевка, мятлик луговой);
• Скрининг аллергенов трав №2 (свинорой пальчатый, плевел, тимофеевка луговая, мятлик луговой, гречка заметная, сорго);
• Скрининг аллергенов трав №3 (колосок душистый, плевел, тимофеевка луговая, рожь посевная, бухарник шерстистый);
• Скрининг аллергенов трав №4 (колосок душистый, плевел, тростник обыкновенный, рожь посевная, бухарник шерстистый);
• Скрининг аллергенов растений (амброзия высокая, полынь обыкновенная, нивяник, одуванчик, золотарник);
• Скрининг аллергенов раннецветущих деревьев (ольха серая, лещина, вяз, ива, тополь);
• Скрининг аллергенов позднецветущих деревьев (клен ясенелистный, береза бородавчатая, дуб, бук крупнолистный, грецкий орех)

Скрининг пищевых аллергенов, определение специфических IgE

• Фрукты (банан, апельсин, яблоко, персик);
• Орехи (арахис, американский орех, фундук, миндаль, кокосовый орех);
• Рыба (треска, креветки, синяя мидия, тунец, лосось);
• Овощи (помидор, шпинат, капуста, красный перец);
• Мясо (свинина, говядина, курятина, баранина);
• Детская пищевая панель №1 (яичный белок, коровье молоко, пшеница, треска, арахис, соя);
• Детская пищевая панель №2 (треска, пшеница, соя, фундук).

15.1. Характеристика микробиологических и иммунологических лабораторий

Вся работа с микробами проводится в лабораториях, которые в зависимости от основных задач могут быть научно-исследовательскими, диагностическими или производственными.

В системе органов здравоохранения имеются:

Клинико-диагностические лаборатории общего или специального (биохимическая, бактериологическая, иммунологическая, цитологическая и др.) типов, входящие в состав больниц, поликлиник, диспансеров и других лечебно-профилактических учреждений;

Бактериологические лаборатории Госсанэпиднадзора (ГСН);

Санитарно-бактериологические лаборатории ГСН;

Санитарно-химические лаборатории ГСН;

Центральные (ЦНИЛ), проблемные, отраслевые, учебные лаборатории вузов;

Специализированные лаборатории (особо опасных инфекций и др.).

В настоящее время лаборатории и более крупные лабораторные учреждения (отделы, институты, производственные предприятия), как правило, специализированные и работают с той или иной группой микробов.

С вирусами работают в вирусологических лабораториях, располагающих соответствующим оборудованием и использующих спе- циальные методы исследования. Существуют микологические и протозоологические лаборатории. Специализированный характер

приобретают и бактериологические лаборатории, в которых работа концентрируется на определенных группах бактерий, например риккетсиозные, туберкулезные, лептоспирозные, анаэробные и др. Иммунологические исследования проводятся в иммунологических лабораториях, хотя отдельные виды исследований могут выполняться и в микробиологических лабораториях, например серодиагностика инфекционных болезней.

Лабораторная работа с патогенными микробами проводится в специально оборудованных лабораториях, обеспечивающих режим работы и технику безопасности, исключающих возможность заражения персонала и утечку микробов за пределы лаборатории.

Необходимость четкой регламентации условий работы с микробами, в различной степени опасными для сотрудников ла- бораторий и окружающего населения, обусловила разработку классификации микробов, разбив их на 4 группы по степени их биологической опасности (классификация ВОЗ). В России в соответствии с рекомендациями ВОЗ патогенные микробы также делят на 4 группы: 1-я группа - возбудители особо опасных инфекций; 2-я группа - возбудители высококонтагиозных эпидемических заболеваний человека; 3-я группа - возбудители инфекционных болезней, выделяемые в самостоятельные нозологические группы; 4-я группа - условно-патогенные микробы - возбудители оппортунистических инфекций. Нумерация групп микробов, принятая в России, отличается обратным порядком от классификации ВОЗ, где к 1-й группе относятся микробы самой низкой патогенности, а к 4-й группе - особо опасные.

В соответствии с делением микробов на группы по степени биологической опасности лаборатории также делят на категории. По номенклатуре ВОЗ выделяют 3 категории микробиологических лабораторий:

Базовые (основные или общего типа) лаборатории, которые в связи с конкретными особенностями работы могут быть оборудованы различными защитными устройствами;

Режимные (изолированные) лаборатории и лаборатории особого режима (максимально изолированные).

Безопасность работ в лабораториях всех категорий обеспечивается выполнением распорядка и правил работы в лаборатории, выполнением требований к лабораторным помещениям и их оснащению, обеспечением лабораторий соответствующим оборудова-

нием, медицинским наблюдением за состоянием здоровья сотрудников, обучением и тренировкой персонала технике безопасности в лаборатории.

15.2. Оснащение микробиологических и иммунологических лабораторий

Помещения базовой лаборатории должны быть просторными для обеспечения безопасного проведения лабораторной работы. Стены, потолок, пол должны иметь гладкую, легко моющуюся поверхность, непроницаемую для жидкостей, устойчивую к дезинфектантам, обычно используемым в лаборатории. Поверхность рабочих столов должна быть водонепроницаемой, устойчивой к дезинфектантам, кислотам, щелочам, органическим растворителям и умеренному нагреванию. Лабораторная мебель должна быть прочной. Пространство под столами и между мебелью должно быть легкодоступно для уборки. В лаборатории должен находиться автоклав для обеззараживания отходов.

Оборудование базовой лаборатории должно ограничивать или предупреждать контакт микробиолога с инфекционным матери- алом, должно быть изготовлено из прочных материалов, непроницаемых для жидкостей, устойчивых к коррозии. Оборудование должно быть сконструировано и установлено так, чтобы оно легко подвергалось чистке, обеззараживанию и проверке.

Лабораторию оснащают микроскопом, автоклавом, термостатами, сушильными, стерилизационными шкафами, аппаратом для свертывания сыворотки, дистиллятором, центрифугами, лабораторными весами, рН-метром, ФЭК, магнитной мешалкой, моечной ванной.

Рабочие помещения лаборатории должны быть снабжены подводкой холодной и горячей воды, электричеством, вакуумом, кис- лородом, воздухом высокого давления и т.п. В некоторых кабинетах оборудуются боксы и вытяжные шкафы.

В число обязательных помещений входят лаборатории кишечных, капельных инфекций, санитарно-бактериологическая, се- рологическая, а также вспомогательные помещения: средоварка, моечная, стерилизационная (чистая и грязная), регистратура, кладовые, санузел для сотрудников, виварий. В лабораториях с пунктами для обследования на носительство микроорганизмов дополнительно оборудуют приемную, процедурную, туалеты для забора

материала. Располагают помещения таким образом, чтобы грязный и чистый потоки не перекрещивались и не соприкасались.

В отношении помещений режимных лабораторий должны соблюдаться те же требования, которые предусмотрены для базовой лаборатории. Кроме того, лаборатория этого типа должна быть отделена от тех частей здания, где передвижение сотрудников не ограничивается. Устройства для мытья рук должны быть снабжены приспособлениями для открывания воды ножной педалью или локтем. Окна должны быть закрыты и заклеены. Входные двери в лабораторные помещения должны быть самозакрывающимися и запирающимися на замок. Вытяжная вентиляция проектируется так, чтобы наиболее низкое давление создавалось в помещениях самой высокой опасности инфицирования. В этом случае движение воздуха будет происходить из вспомогательных помещений в направлении основного рабочего помещения. Отработанный воздух выбрасывается в окружающую среду только после фильтрации через бактериальные фильтры. При оснащении режимных лабораторий оборудованием руководствуются рекомендациями, разработанными для базовых лабораторий, с тем дополнением, что вся работа с инфекционным материалом в них проводится в защитных боксах. В режиме максимально изолированных лабораторий существует ряд особенностей для обеспечения максимальной биологической безопасности персонала, населения и окружающей среды. Вход в лабораторию и выход из нее осуществляются через санитарный пропускник. При входе обязательно полное переодевание в специальную одежду, при выходе перед переодеванием обязательна целевая санитарная обработка (душ, дезинфектанты) персонала. Для снижения риска попадания инфекционного мате- риала в окружающую среду применяют боксирование. С помощью боксов (настольных, ламинарных) создают физические барьеры для предотвращения возможных контактов работающего персонала с инфекционным материалом.

15.3. Правила работы в микробиологической лаборатории

Основные правила работы в базовой лаборатории включают:

Запрет работ с пипеткой при помощи рта;

Запрет приема пищи, питья, курения, хранения пищи и применения косметических средств в рабочих помещениях;

Поддержание чистоты и порядка;

Дезинфекцию рабочих поверхностей не реже 1 раза в день и после каждого попадания на них заразного материала;

Мытье рук персоналом после работы с заразным материалом, животными, перед уходом из лаборатории;

Проведение всех работ таким образом, чтобы свести к минимуму возможность образования аэрозоля;

Обеззараживание всех инфицированных материалов перед выбросом или повторным использованием.

15.4. Принципы микробиологической диагностики инфекционных болезней

Наиболее важное место в лабораторной диагностике инфекционных болезней занимает специфическая микробиологическая диагностика, которую проводят в бактериологической, вирусологической, иммунологической и других лабораториях. Она состоит из трех этапов: преаналитического, аналитического и постаналитического.

Первым этапом микробиологической диагностики является преаналитический, включющий взятие материала для исследования. Выбор исследуемого материала определяется патогенезом и клинической картиной инфекционного заболевания. Исследуемый материал берут по возможности в асептических условиях, помещают в стерильную посуду и как можно быстрее доставляют в лабораторию (желательно в течение 1 ч). В некоторых случаях посев материала проводят у постели больного. Иногда допускается непродолжительное хранение материала в регламентированных условиях. Исследуемый материал сопровождается документом, в котором обязательно указываются время взятия, характер материала, его источник и точно определяется цель исследования.

Материалом для исследования в медицинской микробиологии служат различные биологические и патологические жидкости организма (кровь, гной, моча, мокрота, ликвор, испражнения, рвотные массы, промывные воды и т.п.) и ткань - материал биопсии от живого или аутопсии от трупа. В санитарной микробиологии на исследование берут объекты окружающей среды (воздух, воду, пищевые продукты и т.п.) или смывы с них. При заборе материа-

ла для микробиологического исследования необходимо соблюдать следующие правила:

Материал берут непосредственно из очага инфекции или исследуют соответствующее отделяемое (гной, мочу, желчь и т.п.);

Количество материала должно быть достаточным для проведения исследования и его повторения в случае необходимости;

Материал берут по возможности в начальном периоде болезни, так как именно в этот период возбудители выделяются чаще, их больше, они имеют более типичную локализацию;

Материал берут до начала антимикробной химиотерапии или через определенный промежуток времени после приема антибактериального препарата, необходимый для его выведения из организма;

Следует предупредить возможность попадания в материал антимикробных препаратов (дезинфектанты, антисептики, антибиотики);

Транспортировку материала в лабораторию следует проводить в максимально короткие сроки, в условиях, исключающих гибель неустойчивых видов микробов, или помещать его в специальные транспортные среды;

При транспортировке должны соблюдаться все правила биологической безопасности;

К материалу прилагают сопроводительный документ, содержащий основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования (фамилия, имя, отчество больного, номер истории болезни, клинический диагноз и т.д.).

15.5. Методы микробиологической диагностики

Аналитический этап включает микроскопический, культуральный, биологический, серологический и аллергологический методы микробиологической диагностики.

Микроскопический метод заключается в приготовлении препаратов (нативных или окрашенных простыми или сложными методами) из исследуемого материала и их микроскопии с применением различных видов микроскопической техники (световая, темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная, электронная и др.). В бактериологии микроскопический метод получил название бактериоскопического, в вирусологии - вирусоскопического.

Культуральный метод заключается в посеве исследуемого материала на искусственные питательные среды, культуры клеток или куриные эмбрионы с целью выделения и идентификации чистой культуры возбудителя или возбудителей. В бактериологии культуральный метод получил название бактериологического, в микологии - микологического, в протозоологии - протозоологического, в вирусологии - вирусологического.

Биологический метод (экспериментальный или биопроба) заключается в заражении исследуемым материалом чувствительных лабораторных животных или других биологических объектов (куриные эмбрионы, культуры клеток). Его используют для выделения чистой культуры возбудителя, определения типа токсина, активности антимикробных химиотерапевтических препаратов и т.д.

Серологический метод заключается в определении титра специфических антител в сыворотке крови больного, реже - в обнаружении микробного антигена в исследуемом материале. С этой целью используются иммунные реакции.

Аллергологический метод заключается в выявлении инфекционной аллергии (ГЗТ) на диагностический микробный препараталлерген. С этой целью ставят кожные аллергические пробы с соответствующими аллергенами.

Диагностическая ценность этих методов неравнозначна. Ведущим методом микробиологической диагностики является бак- териологический метод, так как он позволяет выделять и иден- тифицировать микроб-возбудитель, т.е. первопричину болезни. Остальные методы менее информативны, так как они позволяют обнаружить в организме изменения, обусловленные наличием в нем микроба. Второе место по значимости занимает серологический метод, поскольку взаимодействие антигена и антитела характеризуется высокой степенью специфичности. Информативность трех остальных методов невысокая, и они обычно служат дополнением к бактериологическому и серологическому методам. Так, микроскопия исследуемого материала далеко не всегда позволяет увидеть и идентифицировать микробы под микроскопом. Их удается обнаружить только при высокой обсемененности ими материала. Даже обнаружив бактерии под микроскопом, идентифицировать их до вида морфологически нельзя. Как известно, все видовое многообразие бактерий сводится к 4 основным морфологическим формам: кокки, палочки, извитые и ветвящиеся формы. Поэтому по микро-

скопической картине можно весьма ориентировочно отнести увиденные бактерии к крупному таксону, например грамположительным коккам. Только в единичных случаях, когда бактерии имеют уникальную морфологию, микроскопически можно определить их родовую принадлежность. Информативность микроскопического метода грибов и простейших выше, так как грибы и простейшие, являясь эукариотами, имеют более крупные размеры и более характерную морфологию.

Диагностические возможности биологического метода ограничены тем, что к большинству возбудителей антропонозных инфек- ций человека лабораторные животные невосприимчивы, поэтому вызвать у них экспериментальную инфекцию не представляется возможным.

Возможности аллергологического метода ограничены тем, что большинство микробов в организме человека не вызывают ГЗТ.

Поскольку микробиологические исследования являются одним из наиболее дорогих видов лабораторных исследований, перед ми- кробиологом стоит задача постановки достоверного микробиологического диагноза с наименьшей затратой времени, сил и средств. Поэтому для постановки диагноза используют 1-5 методов диагностики, чтобы выбранный набор методов гарантировал правильность ответа.

Особое значение приобретают методы экспресс-диагностики, которые позволяют поставить микробиологический диагноз в течение короткого промежутка времени (от нескольких минут до нескольких часов) с момента доставки исследуемого материала в лабораторию. К числу экспресс-методов относятся РИФ, ИФА, РИА, ПЦР, использование биочипов, хроматография и др. Особенности диагностики анаэробных инфекций изложены в материалах диска.

Наряду с традиционными классическими методами микробиологической диагностики в последние годы все большее значение приобретают молекулярно-биологические методы диагностики (ДНК-зонды, ПЦР, лигазная цепная реакция - ЛЦР, хроматография, электрофорез, иммуноблот, биочипы и др.).

Молекулярно-биологические методы диагностики основаны на идентификации ДНК и РНК, специфичных для данного вида микробов, и включают гибридизацию на основе ДНК-зондов и диагностику на основе ПЦР.

Постаналитический этап микробиологической диагностики заключается в клинической интерпретации результатов лабораторных исследований. При этом лечащий врач должен оценить этиологическое значение выделенных от больного микробов, скорректировать на основании данных микробиологического мониторинга проводимую больному эмпирическую антимикробную химиотерапию и др.

15.5.1. Методы микробиологической диагностики бактериальных инфекций

В бактериологии для обнаружения возбудителя в исследуемом материале используют бактериоскопический, бактериологический, биологический методы.

Достоинствами бактериоскопического метода являются простота, быстрота, экономичность. Однако он находит ограниченное применение, так как может быть использован лишь при наличии каких-либо морфологических или тинкториальных особенностей возбудителя и достаточном его содержании в исследуемом материале. Данный метод является ориентировочным.

Основной и самый точный метод диагностики бактериальных инфекций бактериологический, который используют почти при всех заболеваниях, несмотря на его недостатки: длительность исследования (от 4-5 дней до 2 мес), опасность (так как накапливается чистая культура возбудителя), сравнительную дороговизну. В том случае, если в исследуемом материале предполагается содержание возбудителя в достаточном количестве, посев материала производят на плотные питательные среды для получения изолированных колоний. При незначительном содержании микробов исследуемый материал прежде засевают на жидкие питательные среды - среды обогащения. Идентификацию выделенной чистой культуры производят по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным и токсигенным свойствам (в зависимости от вида возбудителя). Определение перечисленных свойств позволяет установить вид возбудителя. С целью эпидемиологического маркирования производят внутривидовую идентификацию выделенной культуры: определяют ее фаговар, биовар и др. Кроме того, для назначения рационального лечения, как правило, опре- деляют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам.

При микробиологической диагностике заболеваний, вызванных условно-патогенными микробами, представителями нормальной микрофлоры, обязательным является определение количества воз- будителей в исследуемом материале.

Биологический метод неэкономичен, негуманен, поэтому находит ограниченное применение. В качестве экспериментальных животных используют белых мышей, морских свинок, кроликов, обезьян и других животных.

Диагноз инфекционного заболевания возможно установить также с помощью серологического метода, позволяющего обнаружить либо специфические антитела в сыворотке больного, либо специфические антигены непосредственно в исследуемом материале. Антитела к возбудителю заболевания появляются, как правило, к концу первой недели болезни. Невозможность обнаружить их в первые дни заболевания является серьезным недостатком метода, особенно в тех случаях, когда заболевание протекает остро. Кроме того, при многих болезнях требуются изучение антителообразования в динамике и выявление увеличения количества антител, что также не позволяет быстро поставить диагноз. Недостатком метода является и то, что с его помощью нельзя точно идентифицировать возбудителя и определить его антибиотикограмму. Но в то же время это совершенно безопасный, относительно недорогой метод, позволяющий за короткое время поставить диагноз. В настоящее время при ряде болезней определяют не только количество, но и классы иммуноглобулинов.

При некоторых заболеваниях серологический метод применяют для выявления специфических антигенов в исследуемом ма- териале. Поскольку специфические антигены, входящие в состав возбудителя, находятся в патологическом материале с первых минут болезни, этот вариант серологического метода применяют для ускоренной (в течение первого дня болезни) или даже экспрессдиагностики (в течение нескольких часов) инфекционных заболеваний.

В качестве вспомогательного при небольшой группе инфекционных заболеваний используют аллергологический метод, по- зволяющий выявить повышенную чувствительность к специфическому антигену (аллергену), которым является возбудитель заболевания.

15.5.2. Методы микробиологической диагностики вирусных инфекций

В вирусологии методы лабораторной диагностики вирусных инфекций имеют свою специфику, учитывая особенности биологии вирусов. Используются вирусоскопический, вирусологический и серологический методы лабораторной диагностики.

Вирусоскопический метод заключается в обнаружении вируса в исследуемом материале под микроскопом. Чаще используют электронный микроскоп, реже - люминесцентный. Световая микроскопия из-за ничтожно малых размеров вирусов практически не применяется. Лишь для обнаружения крупных вирусов, используя методы сверхокраски, можно применить световой микроскоп. Кроме того, с помощью светового микроскопа можно выявить внутриклеточные включения, которые образуются в пораженных клетках при некоторых инфекциях.

Вирусологический метод заключается в заражении исследуемым материалом чувствительной биологической модели (лабораторные животные, куриные эмбрионы или культуры клеток), индикации вируса и его последующей идентификации. При заражении лабораторных животных индикация вирусов производится, как правило, по клинической картине болезни, патолого-анатомическим изменениям ориентировочно и окончательно, например, с помощью реакции гемагглютинации. Эта же реакция позволяет выявить вирусы в курином эмбрионе, видимых изменений при вскрытии которого, как правило, не наблюдается. В культуре клеток наличие вируса определяют по цитопатическому действию (в том числе образованию внутриклеточных включений), гемадсорбции, феномену бляшкообразования, реакции гемагглютинации, отсутствию изменения окраски индикатора. Идентификация вируса осуществляется с помощью серологических реакций (РПГА, РТГА, РН, РСК, ИФА и др.). Вирусологический метод позволяет точно определить природу возбудителя, но он требует достаточного времени (5-7 дней и более), значительных материальных затрат и небезопасен.

Особенностью серологического метода в вирусологии является исследование парных сывороток. Первую сыворотку берут у больного в острый период в начале болезни, хранят при температуре 4-8 ?С, а вторую сыворотку берут через 10-14 дней. Сыворотки

исследуют одномоментно. О болезни свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра антител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностической является сероконверсия в 4 раза и выше. Так как многие вирусные болезни протекают остро, этот вариант серологического метода обычно применяют для ретроспективной диагностики.

Ведущим методом лабораторной диагностики вирусных инфекций является вирусологический.

Ускоренная и экспресс-диагностика вирусных болезней производится так же, как при бактериальных инфекциях.

15.5.3. Особенности микробиологической диагностики микозов

Для диагностики грибковых инфекций обычно используют микроскопический метод. Микологический метод заключается в по- севе патологического материала на специальные питательные среды, выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам. Особенностью данного метода является его продолжительность - несколько недель из-за медленного роста грибов. Обнаружение антител при серологическом исследовании возможно со 2-4-й нед болезни. При некоторых заболеваниях выявляют специфические антигены в исследуемом материале. Аллергологический метод используют редко. Нередко при микозах применяют гистологический метод, заключающийся в обнаружении элементов гриба (споры, конидиальные головки и т.п.) в органах и тканях, пораженных грибами. С этой целью готовят гистологические тонкие или ультратонкие срезы тканей, окрашивают их специальными гистологическими и гистохимическими методами и исследуют с применением световой, а в случае необходимости и электронной микроскопии.

15.5.4. Особенности микробиологической диагностики протозойных инфекций

Микроскопическое исследование патологического материала заключается в приготовлении как нативных препаратов («толстая капля»), так и мазков, окрашенных по методу Романовского- Гимзе, и является основным методом диагностики заболеваний, вызванных простейшими. В некоторых случаях применяют серологический и аллергологический методы диагностики.

15.6. Принципы иммунологической диагностики болезней человека

Иммунодиагностика - раздел иммунологии, изучающий и разрабатывающий методы диагностики инфекционных и неинфекци- онных болезней, связанных с функцией иммунной системы.

Многие инфекционные заболевания в настоящее время претерпели существенные изменения, что выражается в увеличении удельного веса легких, стертых и бессимптомных форм, росте аллергического компонента, высокой частоте микст-инфекций. Это затрудняет традиционную диагностику заболеваний, поэтому значимость иммунодиагностики, направленной на поиск антигенов возбудителя или специфических иммунных сдвигов в организме больного, возрастает.

Под иммунореактивностью (иммунный статус, иммунный профиль) понимают способность иммунной системы к иммунному ответу в данный момент времени. Ее характеризуют концентрация иммуноглобулинов, количество лимфоцитов и лейкоцитов, соотношение Т- и В-клеток и функциональные показатели, в частности способность иммунокомпетентных клеток отвечать на стимуляцию.

15.7. Контроль качества лабораторных исследований

Важным элементом работы микробиологической и иммунологической лаборатории является получение точных и сопоставимых результатов анализов, для чего необходимо осуществлять контроль качества проводимых исследований. Контроль качества может быть внутрилабораторным и внешним.

Внутрилабораторный контроль качества - система контрольных мер, которые проводятся в отдельной лаборатории персоналом этой лаборатории и направлены на обеспечение соответствующего качественного уровня работы лаборатории.

Внешний контроль качества - система контрольных мер, которые проводятся в рамках единой Федеральной системы внешней оценки качества (ФСВОК) лабораторных исследований группами экспертов и направлены на обеспечение правильной организации технологических процессов производства лабораторных исследований.

Федеральная система внешней оценки качества лабораторных исследований состоит из разделов, в рамках каждого из которых

выполняется оценка качества определенного вида лабораторных исследований. В структуру ФСВОК входят экспертные группы по разработке и проведению внешнего контроля качества в различных видах лабораторных исследований.

Задания для самоподготовки (самоконтроля)

A. Назовите метод микробиологического исследования, позволяющий установить вид возбудителя:

1. Аллергический.

2. Микроскопический.

3. Культуральный.

4. Биологический.

Б. Назовите основную задачу бактериологического метода исследования.

B. У больного с подозрением на вирусную инфекцию на 7 день заболевания была взята сыворотка, в которой обнаружены специфические противовирусные антитела. Оцените достоверность полученного результата исследования.

Г. Назовите тип лаборатории, в которую следует направить материал от больного с подозрением на особо опасную инфекцию.