Анализы на грибок: от видов исследования до правил сдачи биоматериала и цен. Диагностика грибковых заболеваний - основные принципы и методы микробиологических исследований Микозы методы микробиологической диагностики микозов

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА МИКОЗОВ

Взятие материала для лабораторного исследования на грибок.

1.ОСТ 42-21-2-854: приказ № 222/80 от 27.06.00
2.Оснащение: пинцет, предметные стекла, ножницы, ложка фолькмана.
4.Показания: грибковые заболевания.
5.Осложнения: нет.

Подготовка процедурного кабинета:

Смена растворов.

Приготовить:
-1%р-р хлорамина для ветоши
-3%р-р хлорамина – для дезинфекции перевязочного материала и пинцетов
- моющий р-р (156 мл. перекиси водорода + 5 г. моющего порошка + 839 мл. дисцилированной воды) - для обработки пинцетов
- 6% р-р перекиси водорода – для обработки перчаток.

Алгоритм выполнения манипуляции.

Нужно взять пинцет, предметное стекло, ложку фолькмана, ножницы;
- пациента пригласить в перевязочную;
- пациент сидит на стуле или кушетке;
- м/с стоит.

Техника выполнения:

Из очага поражения пинцетом взять чешуйки кожи и волосы;
- взятый материал положить на предметное стекло и закрыть другим предметным стеклом.
- вымыть руки с мылом;
- взятый материал отправить в лабораторию.

СБОР МАТЕРИАЛА

Взять ножницы и предметные стекла;
- ножницами отрезать кусочек от свободного края ногтя;
- взятый материал покрыть другим предметным стеклом;

Ножницы и пинцет замочить в 3% растворе формалина.

Правильный сбор материала из пораженных ногтей - залог успешного микробиологического исследования. Забирая материал, не всегда захватывают участки ногтя, содержащие жизнеспособные грибы. Нежизнеспособные грибы в культуре, естественно, не вырастут, и их вид установить не удастся.

Участок ногтя, который надо взять, определяется формой онихомикоза.

Так, при поверхностной форме онихомикоза следует делать соскобы с поверхности ногтевой пластинки.

При самой распространенной дистальной подногтевой форме наиболее жизнеспособные грибы располагаются под ногтевой пластинкой. Материал, который направляют на исследование, должен включать не только обрезок ногтевой пластинки, но и соскоб с ногтевого ложа, из-под пластинки.

Кроме того, следует захватывать и области неизмененного ногтя, поскольку на границе между ними и пораженными участками ногтя располагаются самые активные грибы.

При проксимальной подногтевой форме брать материал трудно. В этих случаях иногда, особенно если собираются проводить гистологическое исследование или дифференциальную диагностику, предпринимают биопсию ногтя, изредка используют бормашину.

При паронихиях делают соскобы с проксимального валика и из-под него.

Во всех случаях, чтобы избежать бактериальной контаминации, перед взятием образца следует обработать ноготь этиловым спиртом.

МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Микроскопическое исследование патологического материала на грибы производят в нативных и окрашенных препаратах.

Для приготовления неокрашенных препаратов полученный материал размельчают при помощи скальпеля или препаровальной иглы и помещают на середину предметного стекла. Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление (мацерацию) материала. С этой целью прибегают к помощи различных веществ, чаще всего едкой щелочи (КОН, NaOH), которые растворяют эпидермальные чешуйки, слизь, гной, просветляют пигмент волоса и тем самым делают грибы доступными для исследования.

На размягченные чешуйки кожи или ногтя, которые помещают на середину предметного стекла, наносят 1-3 капли 20 - 30% раствора КОН (NaOH). Исследуемый материал в каплях щелочи осторожно подогревают над пламенем спиртовки до появления нежного белого ободка из кристаллов щелочи по периферии капли. Подогревать до кипячения не следует. После подогревания каплю накрывают покровным стеклом, избегая попадания пузырьков воздуха.

Р. А. Аравийский и Г. И. Горшкова (1995) рекомендуют просветленные и накрытые покровным стеклом препараты кожных чешуек и волос оставлять на 5 - 10 мин, а ногтевых пластинок – на 30 - 40 мин до микроскопирования.

Просветление препаратов можно проводить без подогревания, для этого их оставляют в 20% растворе КОН на 30 - 60 мин или используют другие методы просветления патологического материала: хлораллактофенолом по Аману; лактофенолом; раствором, содержащим по 15% диметилсульфоксида и КОН в воде. Хорошие результаты получают после просветления ногтевых пластинок, помещенных в 5% раствор КОН на 24 ч, подогревания в этом случае не требуется.

Микроскопическое исследование производят на обычном лабораторном микроскопе без иммерсии.

Конденсор микроскопа должен быть опущен, диафрагма сужена. В начале препарат находят на стекле при малом увеличении (40х), последующее исследование производят при большем увеличении (100х);

детально препарат изучают при увеличении 400х. Необходимо исследовать несколько препаратов с тем, чтобы увеличить надежность анализа и избежать ложноположительных результатов.

Ошибки в микроскопической диагностике грибов могут возникнуть в связи как с дефектами приготовления препарата, так и с недостаточной опытностью лаборанта.

Дефекты изготовления прежде всего бывают связаны:
с перегреванием препарата, что может привести к выпадению кристаллов щелочи, разрушению волоса и появлению мелкозернистого распада в патологическом материале.

Линейное расположение удлиненных ровных кристаллов щелочи весьма напоминает нити септированного мицелия даже на чистом стекле без патологического материала.

Дифференциально-диагностическими признаками являются исключительное однообразие кристаллов, их стекловидная прозрачность, многогранность краев и отсутствие неразрывной связи одного элемента с другим. В сомнительных случаях рекомендуется добавить к препарату капельки слегка подогретой дистиллированной воды, которые быстро растворяют кристаллы щелочи.

За элементы гриба ошибочно могут быть приняты:

- капельки жира,
- пузырьки воздуха,
- хлопчатобумажные нити одежды
- и так называемый «мозаичный грибок».

Липиды кожных покровов, жировой распад клеток и зерна кератогиалина, особенно имеющие правильную форму, могут напоминать отдельные споры гриба. Но разнообразие формы и, главное, размеров, отсутствие внутренней структуры образований (вакуоли, оболочки) говорят против грибковой природы данных элементов. Липиды также могут попасть в препарат при взятии патологического материала с недостаточно очищенного очага поражения.

Пузырьки воздуха могут напоминать споры дрожжеподобных клеток, но в отличие от последних они окружены плотной темной оболочкой, и даже самые маленькие пузырьки воздуха всегда больше клеток гриба.

Нити от ткани носков, одежды и т. п. обычно лежат отдельно от патологического материала, они всегда больше гифов, грубее и не септированы.

«Мозаичный грибок» представляет собой артефакт, который возникает в процессе кристаллизации (возможно, за счет распада холестерина). Он имеет вид сеточки или петель, очертания которых соответствуют границам роговых чешуек, в отличие от нитей мицелия он никогда не пересекает стенки клеток эпидермиса.

В некоторых лабораториях просветление препаратов для микроскопического исследования проводят 15 - 30% раствором КОН, в который добавляют 5 - 10% коммерческих темно-синих чернил фирмы Паркер (Parker"s Superchrome Blue-Black Ink).

При этой окраске гифы и споры окрашиваются в голубой цвет.

При микроскопии обнаруживают нитевидные гифы грибов или почкующиеся клетки (рис.1).

Таким образом, микроскопия дает заключение только о грибковой природе инфекции, но не о виде гриба-возбудителя.

Конечно, результативность микроскопического исследования зависит от квалификации сотрудника лаборатории.

Рис. 1. Микроскопия соскоба с ногтей, пораженных Т. rubrum. Видны гифы гриба.

КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Проводят посев материала на стандартную среду Сабуро, часто с добавками антибиотиков. В диагностике дерматофитных инфекций принято добавлять в среду Сабуро циклогексимид, подавляющий рост грибов-контаминантов, попадающих из воздуха. Существуют готовые коммерческие среды с добавками антибиотиков и циклогексимида. Следует помнить, что многие плесневые грибы-недерматофиты и некоторые виды Candida не растут на среде с циклогексимидом, поэтому рекомендуется делать посев на среду Сабуро с циклогексимидом и на среду без него. Идентификацию видов обычно проводят при микроскопическом исследовании выросшей культуры или путем пересева на селективные среды (рис. 2-15).

Рис. 2. Культура гриба Т. rubrum, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро (слева) и кукурузном агаре (справа).

Рис. 3. Культура гриба Т. mentagrophytes var. interdigitale, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро.

Рис. 4. Культура гриба Candida albicans. Получена на среде Сабуро.

Рис. 5. Культура гриба Torulopsis glabrata, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро.

Рис. 6. Культура гриба Ulocladium sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 7. Микроморфология Acremonium sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 8. Микроморфология Fusarium sp., вьщеленного из пораженных ногтей.

Рис. 9. Микроморфология Scopulariopsis sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 10. Микроморфология Candida albicans, выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 11. Микроморфология Altemaria sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 12. Микроморфология Aspergillus sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 13. Микроморфология Ulocladium sp , выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 14. Микроморфология Chaetomium sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис 15. Панель питательных фед для идентификации дерматофитов (слева - культура Т rubrum, справа - Т mentagrophytes var. mterdigitale).

Слева направо: среда Сабуро, среда Бакстера, среда Христенсена, кукурузный агар

Следует учесть, что некоторые плесневые грибы, в том числе дерматофиты, в культуре вырастают медленно, за 2-3 нед.

Даже при соблюдении всех правил сбора материала, при хорошем оборудовании лаборатории и высокой квалификации ее персонала число положительных результатов культурального исследования очень невелико.

По данным зарубежной литературы, процент положительных исследований не превышает 50.
Процент положительных результатов в лучших отечественных лабораториях едва достигает 30.

Таким образом, в 2 из каждых 3 случаев онихомикоза его этиологию установить не удается.

ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

В 1925 г. Margaret и Deveze обнаружили, что волосы, пораженные некоторыми дерматофитами, дают характерное свечение в ультрафиолетовых лучах, пропущенных через фильтр Byда. Стекло Byда состоит из сульфата бария, содержит около 9% окиси никеля; оно пропускает лучи длиной 365 нм. В качестве источника ультрафиолетовых лучей можно использовать различные приборы. Природа свечения точно не установлена. Волос продолжает светиться после гибели гриба и после попыток экстрагировать флюоресцирующий материал горячей водой или холодным раствором бромида натрия. Интенсивность и характер свечения зависят от рН раствора. Полагают, что флюоресцирующая субстанция появляется в процессе взаимодействия гриба и растущего волоса.

Свечение в ультрафиолетовых лучах, пропущенных через фильтр Вуда, характерно только для волос, пораженных грибами рода Microsporum (M. canis, M. audouinii, M. ferrugineum, M. distortium, изредка M. gypseum и M. nanum), a также Trichophyton schonleinii. Волосы, пораженные микроспорумами, особенно M. canis и M. audouinii, дают наиболее яркое свечение; волосы, пораженные Т. schonleinii, имеют тусклую зеленоватую флюоресценцию.

Свечение наблюдается только в полностью пораженных грибом волосах. Его может не быть в свежих очагах поражения. В этих случаях следует эпилировать волосы из краевой, наиболее активной зоны, и свечение можно обнаружить в корневой части волос.

Люминесцентный метод можно использовать как для диагностики и контроля за эффективностью лечения у отдельных больных, так и в эпидемиологических очагах. Компактные передвижные установки удобны для обследования контактных людей в школах, детских садах и т. п.

Люминесцентное обследование необходимо производить в затемненной комнате, очаги поражения должны быть предварительно очищены от корок, остатков мази и т. п. Люминесцентный метод можно использовать для диагностики отрубевидного лишая, особенно при локализации очагов поражения на волосистой части головы. Очаги поражения при этом заболевании имеют красновато-желтое или бурое свечение. Это свечение, однако, не является строго специфичным, так как может наблюдаться при наличии перхоти на волосистой части головы и даже у здоровых людей в области устьев волосяных фолликулов на лице и верхней части туловища. Выявленные с помощью люминесцентного метода пораженные волосы должны обязательно подвергаться микроскопическому исследованию.

ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ И БИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммунологические методы исследования используют для выявления специфической перестройки организма и серологической диагностики грибковых заболеваний. Для обнаружения специфических антител в сыворотке пробы проводят следующие серологические реакции: агглютинации, преципитации, связывания комплемента, иммунофлюоресценции с соответствующими антигенами.

Аллергическое состояние организма больного выявляют с помощью аллергических кожных проб. Аллергены наносят на скарифицированную кожу по Пирке или втиранием в кожу по Моро, внутрикожно по Манту, а также уколом в кожу. С помощью этих проб выявляют аллергические реакции как немедленного, так и замедленного типа, что позволяет оценить состояние гуморального и клеточного иммунитета.

Для выявления специфической сенсибилизации лимфоцитов используют реакции дегрануляции базофилов, агломерации и альтерации, тест бластной трансформации, подавления миграции макрофагов и т. п.

Сопоставление результатов серологических и аллергических реакций оказывается полезным как для диагностики, так и для прогноза течения микозов.

Биологический метод. Используется для лабораторной диагностики глубоких и особо опасных микозов. Основан на заражении животных патологическим материалом от больного или культурой исследуемого гриба. Осуществляется в специальных лабораториях.

ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Гистология микозов кожи, обусловленных дерматофитами

Патоморфологические изменения в очагах поражения обусловлены внедрением грибов в роговой слой эпидермиса, волосы и ногти и ответной воспалительной реакцией кожи, которая может быть острой, подострой или хронической. Диагноз можно считать установленным только в том случае, если в гистологических препаратах обнаруживают элементы грибов. Для этого используют различные гистологические окраски, наиболее информативной является периодическая кислотная реакция (PAS), позволяющая выявить полисахариды, имеющиеся в целлюлозе и хитине клеточной стенки большинства дерматофитов (окраска по Шифу и ее модификации). Можно также использовать реакции сульфатирования и импрегнацию гистологических срезов серебром [Хмельницкий О. К., 1973; Lewer W. F. и Schaumburg-Lewerl.,1983].

Грибы в роговом слое эпидермиса, даже при использовании специальных окрасок, выявляются в небольшом количестве в виде нитей мицелия и спор. В редких случаях, когда грибов в очагах поражения много, их можно обнаружить в срезах, окрашенных гемотоксилин-эозином, в виде нежных базофильных структур в роговом слое.

Воспалительные изменения в эпидермисе могут быть различными: от незначительного внутри- и внеклеточного отека шиповатых клеток до выраженного спонгиоза. Спонгиоз обычно развивается при дисгидротических вариантах микозов стоп и кистей, клинически в этих случаях отмечаются пузырьки. Причиной этой реакции обычно является Т. mentagrophytes var. interdigitale. Иногда в эпидермисе отмечается выраженный гиперкератоз, что чаще всего наблюдается при микозе, обусловленном Т. rubrum.

Гистологические изменения в дерме неспецифичны и соответствуют острому, подострому и хроническому воспалению.

При микозе гладкой кожи, вызванном Т. rubrum, грибы иногда выявляются в пушковых волосах и волосяных фолликулах. Вокруг фолликулов развивается воспалительная реакция, которая за счет попадания в дерму грибов может приобретать гранулематозный характер. Центральная часть инфильтрата в этих случаях может подвергаться нагноению и некрозу, а периферическая состоять из лимфоцитов, гистоцитов, эпителиоидных и многоядерных гигантских клеток, внутри которых иногда обнаруживаются споры гриба. Размеры спор здесь достигают 6 мкм в диаметре, в волосе обычно не превышают 2 мкм.

При инфильтративно-нагноительной форме микозов волосистой части головы и области роста бороды и усов элементы грибов обнаруживаются в волосяном фолликуле, внутри и вокруг волоса. В волосе они определяются чуть выше зоны начала кератинизации (примерно на уровне 30 мкм). В дерме отмечают воспалительную реакцию различной интенсив­ности, наиболее выраженную при kerion Celsii. При острой гнойной реакции в составе инфильтрата отмечают большое количество нейтрофильных лейкоцитов, элементы грибов в этом случае могут полностью исчезать. При хроническом те­чении процесса инфильтрат может приобретать гранулематозный характер, в нем появляются многоядерные гигантские клетки. Для подтверждения диагноза при отсутствии в инфильтрате грибов можно использовать иммунофлюоресцентные методы окраски. Для этих целей применяют меченную флюоресцином антисыворотку к Т. mentagrophytes, которая позволяет обнаружить антигены гриба в волосе и в перифолликулярном инфильтрате.

Формирование инфильтративно-нагноительной реакции кожи при микозе волосистой части головы (kerion Celsii) и области роста бороды и усов, обусловленных грибами М. саnis, Т. tonsurans и Т. verrucosum, представляет собой проявле­ние иммунологической реакции. Об этом свидетельствуют:

1. Склонность очагов поражения к спонтанному разрешению.

2. Отсутствие элементов гриба при очень выраженной воспалительной реакции со стороны кожи при микозе, вызванном Т. verrucosum (faviforme) и Т. tonsurans.

3. Постоянная положительная реакция в ответ на внутрикожное введение трихофитина при инфильтративно-нагноительных формах микоза, вызванного зоофильными трихофитинами (например, Т. tonsurans), и отрицательная - при поверхностных микозах, обусловленных тем же Т. tonsurans.

При фавусе в роговом слое эпидермиса обнаруживается большое количество нитей мицелия и единичные споры гриба. Скутула представлена экссудатом, паракератотическими клетками эпидермиса, клетками воспалительного инфильтрата, а также нитями мицелия и спорами гриба, которые расположены преимущественно в периферической зоне скутулы. В активной стадии болезни в дерме вокруг дегенеративных волосяных фолликулов отмечается выраженный воспалительный инфильтрат, содержащий многоядерные гигантские и плазматические клетки. В старых очагах поражения волосы и сальные железы отсутствуют, имеются явления фиброза.

Гистология микозов кожи и слизистых оболочек, обусловленных дрожжеподобными грибами

При кандидозе кожи и слизистых оболочек грибы рода Candida обнаруживаются в роговом слое эпидермиса или в поверхностных слоях эпителия слизистой оболочки. Элементов гриба обычно мало, они хорошо окрашиваются PAS-peакцией или по Граму; представлены в виде нитей септированного ветвящегося мицелия, размером 2-4 мкм в диаметре, или овоидными спорами, размером 3 - 5мкм в диаметре. Диагностическое значение имеет обнаружение мицелиальной формы гриба.

При гистологическом исследовании хронического гранулематозного кандидоза кожи и слизистых оболочек элементы гриба также преимущественно обнаруживают в роговом слое эпидермиса или в самых верхних отделах эпителия слизистой оболочки, но иногда в шиповатом слое, внутри волоса и в дерме. Отмечается также выраженный гиперкератоз и папилломатоз; в дерме – густой воспалительный инфильтрат, состоящий из лимфоидных клеток, нейтрофилов, плазматических и многоядерных гигантских клеток. Инфильтрат может распространяться в подкожную жировую клетчатку.

При отрубевидном лишае в роговом слое эпидермиса обнаруживают большое количество элементов гриба в виде нежных базофильных структур, которые хорошо видны даже при окраске препаратов гемотоксилин-эозином. Грибы представлены как нитями, так и спорами.

При фолликулярной форме отрубевидного лишая отмечается скопление роговых масс и клеток воспалительного инфильтрата в расширенных устьях волосяных фолликулов. Вокруг фолликулов также отмечают воспалительный инфильтрат. При PAS-реакции сферические или овальные споры гриба, размером 2-4 мкм в диаметре, обнаруживают внутри устья волосяных фолликулов, а иногда в перифолликулярном инфильтрате. Мицелий никогда не выявляется.

Нарушение пигментации кожи у больных отрубевидным лишаем обусловлено способностью гриба Pityrosporum вырабатывать субстанцию, которая угнетает процесс пигментообразования в эпидермисе. Электронно-микроскопическое изучение биоптатов кожи с гипопигментированных участков показало, что в меланоцитах образуются очень маленькие меланосомы, которые не способны проникать в кератиноциты. В гиперпигментированных участках кожи, наоборот, меланосомы крупные и содержат большое количество меланина.

Прецизионная диагностика инвазивных микозов нелегка. Это объясняется не только трудностями в получении культуры грибов, но и в интерпретации результатов исследований, поскольку грибами, как дрожжевыми, так и мицелиальными, возможны колонизация слизистых оболочек, контаминация исследуемых образцов. В связи с этим диагностика инвазивных микозов базируется на комплексном подходе, включающем не только результаты микологических (культуральных) и серологических (определение антигена грибов) исследований, но и клинические симптомы грибковой инфекции, данные вспомогательных методов исследований (компьютерная или магнитно-резонансная томография, ультразвуковое исследование).

Европейско-американской кооперированной группой по изучению инвазивных микозов у иммунокомпрометированных больных разработаны критерии диагностики инвазивных микозов. Они представлены в 2001 г. на Международной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (ICAAC, Chicago), а в 2002 г. в печати. Определены критерии доказанного, вероятного и возможного инвазивного микоза, которые рекомендуется использовать при клинических и эпидемиологических исследованиях

Доказанный инвазивный микоз, вызванный мицелиальными грибами : обнаружение мицелия грибов в биоптатах либо аспиратах при гистологическом или цитологическом исследовании или выделение культуры из образцов, полученных в асептических условиях из стерильного в норме очага, который по результатам клинического и радиологического исследований связан с инфекцией, за исключением исследований мочи и со слизистых оболочек.

Доказанный инвазивный микоз, вызванный дрожжевыми грибами : обнаружение дрожжевых клеток (грибы рода Candida могут формировать псевдомицелий или истинный мицелий) в биоптатах или аспиратах, за исключением образцов со слизистых оболочек, или выделение культуры из образцов, полученных в асептических условиях из стерильного в норме очага, который по результатам клинического и радиологического исследований связан с инфекцией, за исключением исследований мочи, образцов из пазух носа и со слизистых оболочек, или обнаружение при микроскопии и специфическом окрашивании (в капле туши, окраска муцикармином) дрожжевых клеток либо положительного антигена Cryptococcus spp. в цереброспинальной жидкости.

Фунгемия, обусловленная мицелиальными грибами : выделение гемокультуры грибов, за исключением Aspergillus spp. и Penicillium spp., включая Penicillium marneffei, в сочетании с клиническими симптомами инфекционного процесса, совместимыми с выделенным возбудителем.

Фунгемия, обусловленная дрожжевыми грибами : выделение гемокультуры грибов рода Candida или иных дрожжевых грибов у пациентов с клиническими признаками инфекции, связанными с данным возбудителем.

Комплекс диагностических исследований при инвазивных микозах

Вероятный инвазивный микоз диагностируют при совокупности следующих критериев:
один признак из категории микробиологических критериев;
один признак из категории «значимых» или два из группы «менее значимых» клинических симптомов инфекционного процесса.

Возможный инвазивный микоз диагностируют на основании совокупности следующих критериев:
наличие хотя бы одного фактора риска, индуцирующего развитие инвазивного микоза;
один признак из категории микробиологических критериев или один признак из категории «значимых» (два из группы «менее значимых») клинических симптомов инфекционного процесса.

Понятие «возможный инвазивный микоз » не рекомендуется использовать в клинических исследованиях по изучению эффективности протигрибковых препаратов. Можно пользоваться этим термином при анализе эмпирической противогрибковой терапии, эпидемиологических исследований, изучении фармакоэкономики.

При микологическом исследовании стерильных аспиратов или биоптатов принимают во внимание выделение не только культуры грибов, но и обнаружение при микроскопии мицелия или псевдомицелия. В гистологических препаратах аспергиллы трудно дифференцировать от Fusarium spp., Sceclosporium apiospermum и некоторых других мицелиальных грибов. Для дифференциальной диагностики следует проводить иммуногистохимическое исследование с антителами к аспергиллам.

Выделение дрожжевых грибов из крови хотя бы в одном исследовании относится к категории «доказанного» инвазивного микоза и является абсолютным показанием к назначению системных антимикотиков больным с нейтропенией. Частота выявления дрожжевых грибов из крови невысокая, даже при диссеминированном кандидозе она составляет 35-50 %.
Проведение повторных посевов крови повышает вероятность получения положительных результатов.

Иная интерпретация результатов в случае обнаружения мицелиальных грибов в крови. Высокая частота выделения мицелиальных грибов характерна для Fusarium spp. и составляет 40-60 %. Aspergillus обнаруживают крайне редко, в большинстве случаев это рассматривается как контаминация, за исключением Aspergillus terreus.

Выделение Aspergillus terreus из крови больных с гемобластозами может свидетельствовать об истинной аспергиллемии, а при наличии клинических симптомов инфекции является основанием для назначения антимикотиков.

Критерии инвазивного микоза

При выявлении в крови или иных стерильных биосубстратов дрожжевых грибов обязательно следует проводить идентификацию до вида и определять чувствительность к противогрибковым препаратам, при выделении мицелиальных (плесневых) грибов - только идентификацию до вида, чувствительность не определяют.

В клинической практике чувствительность мицелиальных грибов не исследуют по причине несовершенства стандартов по определению чувствительности таких грибов к антимикотикам. Более того, только в одном исследовании продемонстрирована корреляция между чувствительностью Aspergillus spp. и результатами лечения инвазивного аспергиллеза у больных с гемобластозами. Ни в одном из исследований, проведенных в последующем, не получено подобных результатов.

В последнее время стали появляться единичные сообщения о формировании приобретенной резистентности грибов A. fumigatus к итраконазолу, вориконазолу.

Идентификация грибов до вида , особенно полученных из стерильных локусов, необходима прежде всего для выбора антимикотика и проведения адекватной противогрибковой терапии. Так, Candida krusei устойчивы к флуконазолу и менее чувствительны, чем дрожжевые грибы другого вида, к амфотерицину В; Aspergillus terreus, Scedosporium apiospermum (Pseudallescheria boydii), Trichosporon beigelii, Scopulariopsis spp. резистентны к амфотерицину В; Mucorales резистентны к итраконазолу, вориконазолу, Candida glabrata проявляет дозозависимую чувствительность к флуконазолу, и при выделении этого вида гриба, даже чувствительных штаммов, дозу флуконазола следует увеличить (взрослым назначают 800 мг вместо 400 мг); Candida lusitaniae устойчивы к амфотерицину В.

Идентификация грибов до вида также важна для проведения эпидемиологического анализа в стационаре - определения возбудителей вспышек инфекции и по возможности источника инфекции. Описаны вспышки инфекции, вызванные такими редкими грибами, как С. lusitaniae, С. krusei, С. lipolytica.

На основании видовой идентификации грибов можно предположить инвазивный микоз или колонизацию грибами слизистых оболочек. Например, Aspergillus niger существенно реже, чем Aspergillus fumigatus, являются причиной инвазивного аспергиллеза у больных острыми лейкозами. Выделение из жидкости бронхоальвеолярного лаважа Aspergillus niger чаще всего расценивается как колонизация дыхательных путей, а из мокроты - как контаминация из воздуха и требует дополнительных исследований при подтверждении диагноза инвазивного аспергиллеза.

На основании выделения мицелиальных грибов из мокроты, бронхоальвеолярной жидкости, аспирата околоносовых пазух можно только предполагать инвазивный микоз, не включая его в категорию «доказанного». Тем не менее обнаружение Aspergillus в мокроте, особенно Aspergillus fumigatus или Aspergillus flavus, у пациентов с нейтропенией, реципиентов аллогенного костного мозга всегда должно быть принято во внимание. Это требует повторного проведения микологического исследования и компьютерной томографии легких. Так, при нейтропении вероятность выявления инвазивного аспергиллеза в случае положительной культуры Aspergillus spp. в мокроте составляет 80 %.

Выделение Cryptococcus neoformans у иммунокомпрометированных больных из респираторного тракта (смывы, лаваж) является диагностически значимым. Если идентификация дрожжевых грибов из жидкостей, полученных из дыхательных путей (смывы из трахеи, бронхов, бронхоальвеолярный лаваж) иммунокомпрометированных больных, не относится к обязательным исследованиям, то проведение скрининга по выявлению Cryptococcus neoformans из этих образцов является необходимым.

Обнаружение кандид в моче у больных с нейтропенией и лихорадкой, как правило, считается проявлением диссеминированной кандидозной инфекции.

В своевременной диагностике инвазивного успешно пользуются коммерческим тестом по выявлению циркуляции специфического антигена грибов Aspergillus spp. галактоманна (полисахаридный водорастворимый компонент клеточной стенки гриба).

Галактоманн может быть определен двумя методами: методом латекс-агглютинации (Pastorex Aspergillus, фирмы BioRAD) и методом иммуноферментного анализа (Platelia Aspergillus, фирмы BioRAD).

Преимуществом иммуноферментного метода является более низкий порог чувствительности определения уровня галактоманна в крови - 1 нг/мл и менее, а с помощью латекс-агглютинации - 15 нг/мл. Диагностическое значение имеет определение галактоманна в крови (не менее чем в 2 образцах), цереброспинальной жидкости, бронхоальвеолярном лаваже. Чувствительность метода иммуноферментного анализа составляет около 90 %, специфичность 90-99 %, у реципиентов аллогенного костного мозга данные показатели ниже и равны соответственно 60-70 % и 80-90 % вследствие профилактического применения противогрибковых препаратов (антимикотики снижают пороговый уровень галактоманна).

В 40 % случаев выявление галактоманна в крови опережает проявления инвазивного аспергиллеза, определяемые при компьютерном исследовании легких, а в 70 % опережает клинические симптомы инфекции.

Диагностическую значимость тест по выявлению антигена Aspergillus имеет в том случае, если исследование проводят неоднократно. Определение антигена Aspergillus в крови следует проводить при лихорадке на фоне лечения антибиотиками широкого спектра действия у больных с нейтропенией 2 раза в неделю; при пневмониях, которые возникают или сохраняются на фоне антибактериальной терапии; при обнаружении очагов в легочной ткани (компьютерная томография).

Клиническая картина грибковых заболеваний кожи весь­ма полиморфна, поэтому во всех случаях диагноз должен быть подтвержден лабораторными методами исследования. Для лабораторной диагностики микозов используют микроскопический, люминесцентный, культуральный, иммунологический (аллергологический и серологический) методы иссле­дования, а также эксперименты на животных.

Лабораторная диагностика микозов складывается из не­скольких этапов. В обычной клинической практике обычно ограничиваются микроскопическим и культуральным иссле­дованием зараженного материала. При необходимости эти методы дополняются иммунологическими, гистологическими исследованиями, заражением экспериментальных животных. При некоторых микозах кожи важную вспомогательную роль в диагностике играет люминесцентный метод.

Взятие патологического материала.

Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от правильного взятия патологического материала. Поскольку грибы способны поражать различные органы че­ловека, при подозрении на микоз необходимо исследовать различный патологический материл. В дерматологической практике чаще всего приходится иметь дело с микозами, при которых исследованию на грибы подлежат кожные чешуйки, волосы, ногти. При подозрении на глубокие и системные микозы может возникнуть необходимость лабораторной диа­гностики на грибы мокроты, промывных вод, мочи, фекалий, гноя, отделяемого слизистых оболочек, крови, кусочков орга­нов и биопсированной ткани.

В очагах поражения на коже, из которых предполагается брать патологический материал, за несколько дней или не­дель необходимо прекратить всякое лечение. Следует иметь в виду, что использование слабых дезинфицирующих раство­ров или даже индифферентных средств может помешать ис­следованию. Непосредственно перед забором патологическо­го материала очаг поражения необходимо обработать 96% спиртом или раствором ксилола. Материал лучше всего брать со свежих, но уже полностью развившихся очагов по­ражения. Кожные чешуйки необходимо соскабливать с пе­риферии очагов, грибы здесь встречаются чаще всего как в виде мицелия, так и спор. Кожные чешуйки снимаются скальпелем, корочки - эпиляционным пинцетом.

У больных микозами волосистой части головы поражен­ные волосы извлекают эпиляционным пинцетом. Для исследования необходимо брать короткие, перекрученные, изогну­тые в виде дуги или запятой, а также длинные, но покрытые чехлом в основании, волосы. При подозрении на фавус необ­ходимо помнить о том, что волосы не обламываются, но ста­новятся тусклыми, безжизненными, седоватыми.

Соскобы с поверхностных очагов пораженных ногтевых пластинок делают скальпелем, утолщенные ногтевые пластинки срезают скальпелем или маникюрными кусачками.

Жидкий патологический материал собирают асептично в стерильную посуду, чешуйки кожи, ногтя и волосы – на листочки простой или мягкой пергаментной бумаги.

Отделяемое со слизистых оболочек для посева берут тампоном из гигроскопической ваты, который затем помеща­ют в сухую стерильную пробирку или пробирку с 2 мл пи­тательной среды (сусло Сабуро). Материал из влагалища получают из заднего свода; с головки полового члена – из области ве­нечной борозды.

Материал из наружного слухового прохода берут петлей или тампоном, который помещают в пробирку.

Поступивший в лабораторию материал исследуют в течение 1 ч после взятия при хранении в условиях комнатной температуры или не более чем через 3 ч при хранении в холодильнике при температуре 4 °С.

Кровь для исследования на грибы берут из локтевой вены в количестве 5 – 10 мл и вносят сразу с колбочку с жидкой питательной средой или равным количеством цитрата натрия.

При необходимости исследования на грибы биопсийного материала его помещают в стерильную чашечку Петри и используют для микроскопии, посевов на питательные среды и приготовления гистологических препаратов.

Микроскопическое исследование.

Микроскопическое исследование патологического мате­риала на грибы производят в нативных и окрашенных препаратах. Для приготовления неокрашенных препаратов полученный материал размельчают при помощи скальпеля или препаровальной иглы и помещают на середину предметного стекла. Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление (мацерацию) материала. С этой целью прибегают к помощи различных веществ, чаще всего едкой щелочи (КОН, NaOH), которые растворяют эпидермальные чешуйки, слизь, гной, просветляют пигмент волоса и тем са­мым делают грибы доступными для исследования.

В некоторых лабораториях просветление препаратов для микроскопического исследования проводят 15 - 30% раство­ром КОН, в который добавляют 5 - 10% коммерческих тем­но-синих чернил фирмы Паркер (Parker"sSuperchromeBlue-BlackInk). При этой окраске гифы и споры окрашива­ются в голубой цвет.

Болезни, вызванные грибками или микозы, являются распространенной проблемой. Возбудителей микозов насчитывается невероятное количество.

Ежегодно открываются учеными и описываются новые виды грибков. Несмотря на это, диагностика и лечение микозов - давно отлаженный и четкий механизм.

Виды грибковых заболеваний

У человека большинство грибков поражают слизистые оболочки и кожу.

К болезням, при которых причиной развития заболевания являются грибки, относятся:

• дерматомикоз
• кандидоз
• онихомикоз
• пёстрый или отрубевидный, разноцветный лишай
• чёрный лишай
• себорея
• аспергиллёз

Методы диагностики микозов

Одна из самых популярных методик - микробиологическая диагностика микозов.

Современные методы диагностики позволяют точно определить, какой грибок был причиной возникновения болезни. В дальнейшем, это дает возможность подобрать оптимальный курс лечения. На данный момент существует три основных метода лабораторной диагностики микозов.

К ним относятся:

• микроскопический
• культуральный
• серологический

Каждый из методов имеет свои преимущества. Культуральная диагностика микозов позволяет определить вид грибков. При этом есть возможность оценить чувствительность колоний к различным препаратам.

Подобный метод позволит подобрать эффективный препарат. Данный способ требует много времени на посев и выращивание колоний.

Микроскопический и серологические методы диагностики микозов требуют меньше времени на проведение. При их использовании тоже определяется вид возбудителя, но проверить его чувствительность к препаратам невозможно. В некоторых случаях возможно использование люминесцентного метода диагностики. Данный метод менее распространен ввиду его сложности.

Люминесцентный метод возможно применять лишь при поражении грибками волос. Метод малоэффективен для диагностики на ранних стадиях. Это обусловлено тем, что эффект свечения будет проявляться лишь при обильном поражении грибком волос.

Диагностика микоза стопы

Микоз стопы является одним из наиболее распространенных дерматомикозов.

Под этим термином принято понимать грибковое поражение кожи стопы и ногтей.

Помните! Заболевание отличается рецидивирующим течением.

Во время диагностики микоза стопы необходимо провести дифференциацию с рядом иных заболеваний. Диагностика микоза стопы базируется на клинических проявлениях и микроскопическом исследовании. Возможно применение культурального метода.

Лечение микозов

Ведущую роль в лечении микозов составляют противогрибковые препараты местного и системного действия.

Лечение местными антимикотиками направлено непосредственно на очаг заболевания. При этом негативное воздействие на организм в целом является минимальным.

Противомикозные препараты системного действия назначают, если:

• местные противогрибковые препараты малоэффективны
• заболевание имеет системный характер

Десенсибилизирующее и антигистаминные препараты назначают, когда микозы сопровождаются воспалительным процессом или аллергическими реакциями. Если к микозам присоединяется вторичная инфекция, возможно назначение антибактериальных препаратов.

Лечение грибковых заболеваний важно начинать на ранних стадиях болезни. Если процесс давний, для лечения может потребоваться больше времени.

При появлении первых симптомов незамедлительно обращайтесь за помощью к нашему врачу.

Основой диагностики грибковых заболеваний является микроскопическое исследование препаратов, приготовленных из пораженных участков кожи и ногтей. Однако микроскопическая картина при разных видах микозов сходная: в кожных чешуйках и ногтях видны споры грибков и ветвистый септированный мицелий диаметром 4-7мкм. Поэтому род и вид гриба в большинстве случаев не может быть определен по микроскопической картине в кожной чешуйке или в соскобе с ногтя. Для идентификации возбудителя проводят посевы на питательные среды, чаще всего на среду Сабуро.

Эпидермофития. Поражается роговой слой кожи, чаще всего стоп, и ногти нижних конечностей. Волосы никогда не поражаются. На ногтях появляются желтые пятна или полосы, затем развивается гиперкератоз (утолщение ногтей), их деформация и разрушение. На коже стоп появляется пластинчатое шелушение подошв и межпальцевых складок, покраснение. Иногда образуются пузыри, опрелости, трещины. Заболевание сопровождается зудом, жжением, болезненностью.

При микроскопическом исследовании соскобов, чешуек, покрышек пузырей определяются малосептированные нити мицелия диаметром 3-5мм, часть нитей распадается на круглые и прямоугольные споры.

Трихофития. Это грибковое заболевание кожи и ее придатков с особой склонностью поражать волосы [лат. trichos волос + phyton грибок]. На волосистой части головы появляются многочисленные очаги поражения диаметром около 1,5см. Кожа на них отечная, гиперемирована, покрыта чешуйками. Волосы в очагах обламываются на уровне 2-3мм над поверхностью кожи, откуда и название «стригущий лишай».

Микроскопическое исследование выявляет характерную особенность грибов вида трихофитон - расположение их спор цепочками. В зависимости от свойств грибов различают:

Endothrix (возбудитель поверхностной трихофитии). Грибы растут внутри волоса, резко изменяя его структуру. Весь волос заполнен (нафарширован) параллельными рядами цепочек, состоящих из крупных округлых или квадратных спор;

Ectothrix (возбудитель глубокой трихофитии), при котором волос окутан чехлом из мелких или крупных спор, расположенных вдоль оси цепочками.

Фавус – парша. Поражаются волосы и кожа, реже – ногти. Волосы становятся тонкими, тусклыми, «припудренными», как старинные парики, но не обламываются. Для поражения кожи характерно появление корочек желто-серого цвета (щитков) с приподнятыми, как у блюдцев, краями.

При микроскопическом исследовании выявляются пузырьки воздуха внутри пораженного волоса.

Микроспория. Поражаются кожа и волосы. В очагах поражения волосы обламываются на уровне 6-8мм над поверхностью кожи. Вокруг оставшихся пеньков заметны беловатые чехлы.

При микроскопическом исследовании пораженных волос видны споры, располагающиеся вокруг и внутри волоса мозаично (беспорядочно). Они очень мелкие (1-3мм), отсюда и название болезни. Диагностике микроспории помогает характерное люминесцентное свечение волос.

При микроскопическом исследовании обнаруживают округлые почкующиеся клетки, часто в виде виноградной грозди.

Глубокие (плесневые) микозы. Чаще встречаются как профессиональные заболевания на предприятиях по производству антибиотиков, у сельскохозяйственных рабочих, контактирующих с заплесневевшим зерном, сеном, компостом и т.д. Возбудитель пенициллиоза (гриб-кистевик) имеет грубый, широкий, септированный мицелий, заканчивающийся кисточкой. Возбудитель мукороза имеет широкий несептированный мицелий, заканчивающийся сумкой со спорами. Возбудитель аспергиллеза (леечная плесень) часто содержится на заплесневевших фруктах, хлебе. Имеет грубый септированный мицелий, заканчивающийся расширением, от которого отходят нити со спорами, напоминающими лейку со струйками воды.

Актиномикоз. Вызывается разными видами лучистого грибка. Характеризуется образованием на коже, слизистых оболочках и во внутренних органах плотных инфильтратов, склонных к нагноению и появлению свищей. На глаз в отделяемом свищей видны мелкие желтые зернышки с характерным лучистым краем – друзы актиномицета. Препараты для микроскопии готовят из отделяемого свищей и мокроты.

При малом увеличении друзы лучистого грибка имеют вид желтоватых образований округлой формы со светлой аморфной серединой и более темной окраской по краям. При большом увеличении в центре друзы определяются нити мицелия, а по периферии – колбовидные вздутия. При окраске по Граму нити мицелия Г+, а колбочки Г-.