Ифа суммарный качественный норма. Иммуноферментный анализ (ИФА)Enzyme immunoassay (EIA)

Инфекция, вызванная вирусом иммунодефицита человека, – серьезный диагноз. Ошибки при диагностике могут привести к плачевным последствиям. Анализ ИФА на ВИЧ – наиболее доступный метод исследования, но не во всех случаях он информативен.

ИФА – иммуноферментный анализ. Задача метода ИФА – выявление антител к вирусу иммунодефицита в биологическом материале. С помощью метода можно отследить присутствие в жидкости не самих вирусов, но только антител, вырабатывающихся в ответ на их присутствие. Иммуноферментный анализ широко используется при диагностике ЗППП. Он помогает выявить , передающиеся половым путем.

Существует несколько видов ИФА: прямой вариант, косвенный вариант, метод «сэндвича». В любом случае методика основана на определении наличия антител, которые служат индикатором проникновения чужеродного агента. Чтобы выявить эти «метки», биологический компонент обрабатывают ферментами.

Иммуноферментный анализ определяет антитела с точностью 96 – 98%, погрешность незначительна. Она составляет 2 – 4%.

ИФА – метод диагностики ВИЧ

ИФА анализ на ВИЧ – это первый этап диагностики. Антигенами вируса иммунодефицита являются протеины p24, p15, p17, p31 и гликопротеины gp 41, gp55, gp66, gp120, gp160.

Чтобы обнаружить вирусный белок, берут порцию крови из вены. Образец, направленный на исследование крови ИФА, обрабатывают иммуноферментными реагентами. Из крови выделяют сыворотку. Если в ходе исследования обнаруживаются , значит, в крови уже присутствует вирус.

Кровь сдают строго натощак. За 2 дня до анализа не рекомендуется есть жирную пищу и употреблять алкоголь. Следует за 14 дней прекратить прием противовирусных препаратов.

Преимущества метода:

• сравнительно небольшая стоимость;
• высокая стабильность реагентов;
• высокая чувствительность;
• короткий срок проведения;
• минимальное влияние человеческого фактора.

Современные тест-системы для ИФА производят по мировым стандартам. Это повышает точность метода.

Иммуноферментный анализ не всегда дает достоверные результаты. После попадания вируса в кровь начинается латентная (скрытая) стадия развития. Период, пока вирусы не начали размножаться, и антитела еще не сформированы, называется «время серонегативного окна». Делать ИФА на этом этапе бессмысленно. Если заражение произошло, результат будет . Как быстро вирус себя обнаружит, зависит от того, какое количество опасных клеток попало в организм. При незащищенном половом акте или переливании зараженной крови этот срок будет минимальным.

Для высокой достоверности ИФА на ВИЧ исследование проводят трижды. Сроки сдачи ИФА на вирус иммунодефицита человека:

• через 6 недель после вероятного контакта,
• через 3 месяца,
• спустя полгода.

ИФА 4 поколения на ВИЧ – метод, наиболее информативный на ранних сроках заражения. Его можно проводить уже через 1 месяц после предполагаемого инфицирования. Тест на является дорогостоящим по сравнению с аналогом 3-го поколения. Поэтому в государственных медучреждениях он используется как дополнительный метод диагностики. Бесплатно проводится тест 3. Если по его итогам однозначного ответа дать нельзя, пациента направляют на ИФА 4 поколения.

Важно! Сразу после инфицирования человек становится заразным. Он опасен для окружающих, даже когда еще не знает о своем диагнозе!

Если при ИФА выявлены антитела к антигенам ВИЧ, необходимо проводить дополнительные исследования. К таким относится . Достоверность этого метода – 80%. С помощью ПЦР исследуют кровь, сперму и влагалищные выделения. Биологическую жидкость расщепляют в медицинском реакторе, затем подвергают обработке ферментами. В итоге получают данные о том, какова концентрация клеток ВИЧ в жидкой среде. Из-за большой погрешности (20%) при положительном результате дополнительно проводят иммунный блоттинг.

Следующий этап диагностики – тест Комбо (или иммунный блоттинг). Это высокочувствительное исследование (98% достоверности), которое проводят, если через 6 месяцев результаты ИФА неоднозначны.

Расшифровка результатов ИФА

Время расшифровки составляет от 24 до 48 часов. Если необходимо получить информацию срочно (требуется хирургическое вмешательство), расшифровку проводят за 2 часа. В провинциальных медицинских пунктах не всегда есть необходимые реагенты. Пробу берут по месту обращения, затем ее передают в областной центр. При таких обстоятельствах итог можно узнать через 1- 2 недели.

Результат иммуноферментного анализа может быть либо положительным, либо отрицательным; других вариантов нет.

Даже если при первичном и повторных ИФА итог был положительным, пациента нельзя признать ВИЧ-инфицированным. Возможна погрешность. Причины ложноположительного результата:

• хронические заболевания;
• длительные инфекционные заболевания;
• беременность.

Поэтому результат анализа должен быть уточнен дополнительными исследованиями.

Если при проведении иммуноблоттинга на ВИЧ (реактивный), человек считается ВИЧ-инфицированным, а значит, что он здоров.

Клетки вируса со временем адаптируются к назначенным препаратам. Чтобы контролировать , тест ИФА периодически повторяют.

Иногда иммуноблоттинг показывает ложноотрицательный результат. Крайне редко вирус иммунодефицита 6 месяцев (и более) . Это возможно, если в кровь попало незначительное количество клеток вируса. В 0,5% от общего числа случаев диагностировать заражение удается лишь через год. В 99,5% в течение полугода после инфицирования при проведении ИФА получится достоверный результат.

Даже при проведении высокоточных исследований остается вероятность ошибки, составляющая 2%. Не следует забывать о человеческом факторе. Чтобы исключить вероятность ошибки, тест можно провести в 2-х разных учреждениях.

Содержание

Для оценки способности организма сопротивляться инфекционным болезням или для определения фазы патологии применяют анализ крови. Метод ИФА занимает важное место среди лабораторных исследований, он помогает всесторонне изучить деятельность защитной функции крови, определить иммунодефицит при инфекционных заболевания, недугах крови, гормональных, аутоиммунных процессах.

Что такое иммуноферментный анализ крови

Этот метод относится к лабораторным исследованиям, определяет наличие защитных факторов крови белковой природы (антител) к определенным болезнетворным агентам (антигенам) . Иммуноферментный анализ крови определяет иммуноглобулины, которые могут обнаруживаться в виде иммунокомплексов. Появляются они при возникновении сложных нейрогуморальных реакций иммунной защиты человека, которые становятся ответом на внедрение чужеродных антигенов.

Против каждого вида болезнетворного агента производятся в организме специфические антитела. Далее происходит связывание патологического микроорганизма или антигена, образуется комплексное соединение «антиген-антитело». Затем оно нейтрализуется, происходит ферментативный лизис, реакция фагоцитоза, и заканчивается процесс выводом из организма. Наличие конкретных комплексов, определяющееся ИФА, говорит о виде возбудителя, вредного вещества у больного.

Классы иммуноглобулинов

Учеными обнаружено и изучено 5 видов иммуноглобулинов: IgE, IgD, IgG, IgM, IgА . Существуют и другие классы, но они находятся еще на стадии исследования, и не до конца выяснена их роль. В практической медицине важное значение имеют А, М, G. Информативность, точность определения базируется на временных промежутках, за которые они появляются, достигают максимума и исчезают.

Показания к исследованию крови методом ИФА

При помощи этого анализа можно оценивать эффективность лечения, проводить комплексное исследование перед трансплантологическими операциями, определять состояние иммунодефицита и антитела к более 600 видов аллергенов . Исследование крови методом ИФА использует в качестве дополнительного способа обнаружения онкологических клеток. Назначают анализ при необходимости обнаружения антител к микробам, которые провоцируют венерические патологии:

• трихомониаз;
• сифилис;
• токсоплазмоз;
• микоплазмоз;
• уреаплазмоз.

При глистных инвазиях в анализе ИФА будет отмечен рост количества иммуноглобулинов. Проводится исследования для подтверждения наличия у больного:

• вируса Эпштейна-Барра;
• герпетических инфекций;
• цитомегаловируса;
• группы вирусных гепатитов.

Анализ крови методом ИФА

Иммуноферментное исследование крови не единственный вариант для определения иммуноглобулинов. Иногда для этого исследования делают забор спинномозговой жидкости, ткани стекловидного тела, околоплодных вод. При использовании крови набирают ее из локтевой вены при помощи инъекционной иглы. Сдавать анализ необходимо натощак, перед ИФА не рекомендуется принимать медицинские препараты, которые могут повлиять на результат. Следует отказаться от алкоголя, курения, употребления наркотических веществ перед сдачей биоматериала. Варианты результатов теста:

1. При отрицательных показателях иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA, врачи говорят об отсутствии патологии или начальной стадии. Такой же результат (отрицательный) будет после полного выздоровления по прошествии длительного периода.
2. Если IgG проявляется положительно, а IgM и IgA не обнаружены, это указывает на образование иммунитета после прививки или инфекционной болезни.
3. При высоких титрах IgM и отрицательных IgA, IgG ставят диагноз острого инфекционного заболевания.
4. При положительном показателе IgG, IgM, IgA врачи говорят об острой фазе рецидива уже имеющегося хронического недуга.
5. При хронической инфекции, которая находится на стадии стихания (ремиссии), анализ ИФА показывает отрицательные титры IgM, а IgA и IgG будут положительными.

Преимущества и недостатки ИФА анализа

Основным отрицательным моментом этого исследования является вероятность получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Причиной недостоверности становится прием медикаментов, технические недочеты лаборатории. Фальсифицировать анализ может процесс нарушения метаболизма в организме. Главными достоинствами анализа ИФА являются:

• точность, диагностическая специфичность;
• невысокая себестоимость анализа;
• скорость получения результатов;
• возможность динамического контроля стадии патологии, эффективности лечения;
• простота исследования;
• возможность выполнять массовые обследования очагов инфекции;
• безболезненность, безопасность для больного;
• применение при обработке информационных технологий.

Видео

Нашли в тексте ошибку?
Выделите её, нажмите Ctrl + Enter и мы всё исправим!

В связи с развитием клеточных технологий, молекулярной биологии, генетики, физики, химии и ряда других высокотехнологичных дисциплин в повседневную практику внедряются новые высокоточные и высокотехнологичные методы. Данные междисциплинарные тенденции затрагивают и область медицинских знаний, и смежные области биологических, биохимических проблем. За последние десять лет получил широкое распространение и внедрение в массовую практику метод клинической лабораторной диагностики под названием иммуноферментный анализ.

Вообще технологии иммунологических ферментативных и радиологических реакций широко использовались в типировании клеток, культур клеток, различных тканей с начала 80-х годов XX столетия. Однако методы эти были очень трудоемкими, не унифицированными, не стандартизированными, что исключало их использование в лечебно-диагностических целях в массовом порядке. Такими методами пользовались лишь узкие, наукоемкие и высокоспециализированные лаборатории.

Однако с развитием техники, микротехники, производства различных биополимерных материалов стало возможным производить готовые наборы иммуноферментной диагностики, которыми смогут пользоваться лаборатории лечебно-профилактических учреждений широкого профиля. ИФА широко используется для диагностики всевозможных инфекций (хламидиоз , сифилис , цитомегаловирус , токсоплазмоз , герпес и т.д.), как острых, так и хронических, а также скрытых форм, которые протекают без клинических симптомов.Также этот метод применяют для контроля над хроническими заболеваниями. Давайте постараемся разобраться, что это за метод, и какие принципы лежат в его основе?

Компоненты иммуноферментного анализа – иммунная реакция и ферментативная реакция

Иммунная реакция, что это? Что такое антитело, антиген?

Что такое иммунная реакция? Что такое антиген?

Индивидуальные и видовые антигены – что это? Зачем нужны эти антигены?

Имеются антигены индивидуальные , то есть присущие только данному конкретному организму. Эти индивидуальные антигены разные у всех людей, есть похожие друг на друга, но все равно отличающиеся. Двух одинаковых копий индивидуальных антигенов в природе не существует!

Второй основной тип антигенов – это видовые антигены , то есть присущие какому-либо конкретному виду живых существ. Например, у человека присутствует свой видовой антиген, общий для всех людей, у мышей имеется свой мышиный видовой антиген и т.д. На поверхности каждой клетки обязательно присутствуют видовой и индивидуальный антиген.

Видовой антиген используют клетки иммунной системы для опознавания «свой – чужой».

Как происходит узнавание антигена?

Иммунная клетка связывается с подозрительной клеткой и проводит опознание именно по индивидуальному антигену. В памяти иммунной клетки «записано» как выглядит «свой антиген». Таким образом, если антиген подозрительной клетки совпадает с описанием «свой антиген», значит, эта клетка собственного организма и опасности не представляет. Тогда иммунная клетка «отвязывается» и уходит. А если антиген не совпадает с описанием «свой», тогда иммунная клетка идентифицирует эту клетку как «чужой», а значит потенциально опасный для всего организма. В этом случае иммунная клетка не «отвязывается», а начинает уничтожать опасный объект. Точность такого иммунологического узнавания поражает воображение – 99,97%. Ошибок практически не бывает!

Что такое антитело, иммунный комплекс?
А что представляет собой антитело?

Антитело – это особая молекула, расположенная на поверхности иммунной клетки. Именно антитело и связывается с антигенами подозрительной клетки. Далее антитело передает информацию внутрь клетки, где происходит опознавание, и получает обратный сигнал двух видов «свой» или «чужой». При сигнале «свой» антитело разрушает связь с антигеном и отпускает клетку.

Что такое иммунный комплекс?
При сигнале «чужой» ситуация разворачивается иначе. Антитело не разрывает связь с антигеном, а наоборот, посылая специфические сигналы, вызывает «подкрепление». Биологически это означает, что другие антитела, находящиеся в другой части клетки, начинают перемещаться к участку, откуда идет сигнал опасности, и также образуют связь между собой и пойманным антигеном. В конце концов, антиген оказывается, окружен со всех сторон и прочно привязан.Такой комплекс антиген + антитело называется иммунный комплекс . С этого момента начинается утилизация антигена. Но сейчас подробности процесса нейтрализации антигена нас не интересуют.

Виды антител (IgA , IgM , IgG , IgD , IgE )
Антитела – это белковые структуры, которые, соответственно, имеют химическое название, которое и используется как синоним слова антитела. Итак, антитела = иммуноглобулины .

Существуют 5 типов иммуноглобулинов (Ig) , которые связываются с разными видами антигенов в разных местах человеческого организма (например, на коже, на слизистых, в крови и т. д.). То есть антитела имеют разделение труда. Эти иммуноглобулины называются буквами латинского алфавита – A, M, G, D, E и обозначаются следующим образом – IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.

В диагностике используют только один вид антител, который наиболее специфичен в отношении определяемого микроба. То есть связывание данного вида антител с определяемым антигеном происходит всегда. Чаще всего применяются IgG и IgM.

Именно этот принцип иммунной реакции (уникальная точность и специфичность узнавания определяемого биологического объекта) лежит в основе иммуноферментного анализа.В силу высокой точности антител в узнавании антигенов, точность всего метода иммуноферментного анализа оказывается также высочайшей.

Ферментативная реакция

Что такое ферментативная реакция?

Ферментативная реакция – это химическая реакция, при которой одно вещество под действием фермента превращается в другое. Вещество, на которое действует фермент,называется субстратом . А вещество, которое получается в результате воздействия фермента, называется продуктом реакции . Причем особенность ферментативной реакции такова, что определенный фермент действует только на определенный субстрат. Такое свойство фермента узнавать «свой» субстрат называется сродством .

Таким образом, каждый фермент проводит только одну, специфичную для него реакцию. Ферментов в биологическом мире известно великое множество, равно как и ферментативных реакций. В иммуноферментной диагностике используется лишь несколько ферментативных реакций – не более 10.При этом выбирали такие ферментативные реакции, продуктом которых являются окрашенные вещества. Почему же продукты ферментативной реакции должны быть окрашенными? Потому что для вычисления концентрации вещества по окрашенному раствору существует простой химический метод – колориметрия .

Метод колориметрии – суть и принцип

Колориметрия

Далее измеряют плотность окраски раствора, концентрацию которого выясняют, и по калибровочному графику находят значение концентрации, соответствующее уровню измеренной плотности окраски раствора.В современных автоматических колориметрах только один раз проводят калибровку, далее аппарат сам строит калибровочную кривую, которая остается в памяти прибора, и измерение происходит автоматически.

В иммуноферментном анализе чаще всего применяются следующие ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза , авидин.

Как же совмещаются иммунологическая и ферментативная реакция в иммуноферментном анализе? Сейчас мы перейдем к рассмотрению собственно иммуноферментного анализа. Какие этапы он включает и что происходит при протекании этих реакций? Иммуноферментный анализ бывает прямой и непрямой .

Прямой иммуноферментный анализ – этапы проведения

Прикрепление антигенов к поверхности лунки и соединение антигена с антителом

Как проходит прямой иммуноферментный анализ? Берется биологический материал (кровь, соскобы со слизистых, мазки) и помещается в специальные лунки. Биологический материал оставляют в лунках на 15-30 минут, чтобы антигены могли приклеиться к поверхности лунок. Далее в эти лунки добавляют антитела к выявляемому антигену. Это значит, что выявляя антигены, например, сифилиса, добавляются антитела против антигенов сифилиса. Эти антитела получают промышленным способом, а лаборатории покупают уже готовые наборы.Данную смесь исследуемого материала и антител оставляют на некоторое время (от 30 минут до 4-5 часов), чтобы антитела смогли найти и связаться со «своим» антигеном.Чем больше в биологической пробе антигенов, тем больше антител свяжется с ними.

Удаление «лишних» антител

Как было указано, антитела к тому же связаны со специфической меткой.Поскольку антитела добавляются в избытке, то не все они свяжутся с антигенами, а если антигена вообще нет в пробе, то, соответственно, ни одно антитело не свяжется с искомым антигеном. Для того чтобы убрать «лишние» антитела, содержимое из лунок просто выливают. В результате этого все «лишние» антитела убираются, а остаются те, которые связались с антигенами, поскольку антигены «приклеены» к поверхности лунок. Лунки несколько раз ополаскивают специальным раствором, который позволяет вымыть все «лишние» антитела.

Далее начинается второй этап – ферментативная реакция. В промытые лунки добавляют раствор с ферментом и оставляют на 30-60 минут. Данный фермент имеет сродство к веществу (специфической метке), с которым связаны антитела. Фермент проводит реакцию, в результате которой эта специфическая метка (субстрат) превращается в окрашенное вещество (продукт). Затем методом колориметрии находят концентрацию этого окрашенного вещества. Поскольку данная специфическая метка связана с антителами, значит, концентрация окрашенного продукта реакции равна концентрации антител. А концентрация антител равна концентрации антигенов. Таким образом, в результате проведенного анализа мы получаем ответ, какова концентрация выявляемого микроба или гормона.

Именно так проходит прямой иммуноферментный анализ. Однако сегодня чаще используют непрямой иммуноферментный анализ, поскольку чувствительность и точность непрямого выше, чем прямого. Итак, перейдем к непрямому иммуноферментному анализу.

Непрямой иммуноферментный анализ – этапы проведения

Фиксация антигенов на поверхности лунки и связывание антигена с немеченым антителом
Так же как и для прямого иммуноферментного анализа производится забор биологического материала – кровь, соскобы, мазки. Исследуемый биологический материал вносят в лунки и оставляют на 15-30 минут для приклеивания антигенов к поверхности лунок. Затем в лунки вносят немеченые антитела к антигенам и оставляют на промежуток времени (1-5 часов), чтобы антитела связались со «своими» антигенами и образовали иммунный комплекс (первый этап ). После чего удаляют «лишние», не связавшиеся антитела, путем выливания содержимого лунок. Производят промывку специальным раствором для полного удаления всех не связавшихся антител.

Связывание меченого антитела с комплексом антиген + немеченое антитело
После чего берут вторые антитела – меченые, добавляют в лунки и опять оставляют на некоторое время – 15-30 минут (второй этап ). За это время меченые антитела связываются с первыми – не мечеными и образуют комплекс – антитело + антитело + антиген. Однако и меченые, и не меченые антитела вносятся в лунки в избытке. Поэтому нужно опять удалить «лишние», уже меченые антитела, которые не связались с немечеными антителами. Для этого повторяют процедуру выливания содержимого лунок и промывки специальным раствором.

Ферментативная реакция – образование окрашенного соединения
После чего вносят фермент, осуществляющий реакцию превращения «метки» в окрашенное вещество. Окраска развивается в течение 5-30 минут. Затем проводят колориметрию и вычисляют концентрацию окрашенного вещества. Поскольку концентрация окрашенного вещества равна концентрации меченых антител, а концентрация меченых равна концентрации немеченых антител, которая, в свою очередь равна концентрации антигена. Таким образом, получаем концентрацию выявляемого антигена.
Такой двойной контроль в виде использования двух видов антител позволил повысить чувствительность и специфичность метода иммуноферментного анализа. Несмотря на удлинение времени проведения анализа и включение дополнительных этапов, эти потери компенсируются точностью результата. Именно поэтому в настоящее время подавляющее большинство методик иммуноферментного анализа – это непрямой иммуноферментный анализ.

Какие заболевания выявляют методом иммуноферментной диагностики?

Самойликов Павел Владимирович интерн кафедры «Клинической лабораторной диагностики»

Российский государственный медицинский университет

Методы иммунного анализа широко вошли в медицинскую практику. Во всех областях современной медицины используется иммунный анализ, преимущественно, с диагностической и аналитической целями. Особенно важно, что они дают возможность идентифицировать биологические компоненты (гормоны, ферменты, нейропептиды, продукты иммунной системы, антигены и т.д.) в низких и очень низких концентрациях. Все продукты, против которых возможно получение антител, выявляются этими методами.

Иммунный анализ основывается на взаимодействии антигена (АГ) и антитела (АТ) с использованием различных вариантов мечения одного из компонентов (фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель и другие). Оценка реакции проводится автоматически на специальной аппаратуре, что позволяет стандартизировать эти методы.

В зависимости от типа используемой метки и условий постановки теста иммунный анализ обозначается как иммуноферментный (ИФА), радиоиммунный (РИА), иммунофлуоресцентный и другие. При постановке реакций в один или несколько этапов они обозначаются как прямые или непрямые. Имеет значение среда, в которой проводится реакция. Если реакция проводится с реагентами, фиксированными на поверхности, то тест обозначается как твердофазный, например ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).

В данной работе будет рассмотрен только иммуноферментный анализ – метод широко распространенный в биологии и медицине, как практической, так и фундаментальной.

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс.

Рисунок 1. Основной принцып ИФА.

1) Для выявления антигенов. 2) Для выявления антител.

Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 1).

Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.

Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой:

+[АГ]↔[АТАГ]

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.

А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.

Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные.

Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.

В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.

При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.

Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.

Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.

3. По принципу определения тестируемого вещества:

А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.

Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

Ферменты.

Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

– высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

– наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

– возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

– отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза (табл.1). Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Субстраты.

Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Основные требования к субстрату:

– обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;

– образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;

– субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.

Таблица 1.

Ферменты и их субстраты наиболее широко используемые в ИФА.

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.

Антигены и антитела.

АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочишенными и высокоактивными. Кроме того, АГ должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант, чужеродностью и гомогенностью. Многие синтетические и рекомбинантные АГ вирусов и бактерий хорошо себя зарекомендовали при использовании в ИФА. Это существенно повысило специфичность и воспроизводимость метода за счет сведения к минимуму перекрестных реакций.

Одним из наиболее важных реагентов в ИФА являются антитела. Чувствительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител. Используемые антитела могут быть поли- или моноклинальными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgGl, IgG2), антиаллотипическими или антиидиотипическими. При низкой аффинности AT распад комплекса АГ-АТ приводит к удалению связанного АГ из системы. Чувствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации АГ (AT) в испытуемых образцах.

Образование конъюгата

Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Образование коньюгата – один из важных этапов проведения ИФА.

При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент - способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело - антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы приготовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом доступных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реагентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.

Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15 - 60 % от свободного фермента). Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фермента.

В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фермента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 молекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую ферментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких образовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 - 10 %).

Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).

Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:

Высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, уменьшить неспецифическое связывание;

Достаточной специфичностью в рабочем разведении;

Преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные формы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;

Оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);

Достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство определяется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.

Твердая фаза

В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещества. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями:

– пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками и синтетической поверхностью;

– ковалентное прикрепление к твердой фазе;

– иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение).

Пассивная адсорбция белков широко используется при проведении ИФА на платах для титрования, на нитроцеллюлозных мембранах. Пассивная адсорбция идет по принципу насыщения и коррелирует с молекулярной массой адсорбируемого вещества. Адсорбционная поверхность мембран различного типа (нитроцеллюлоза, нейлон и др.) в 100-1000 раз выше, чем у пластика.

Полисахариды и сильногликозилированные белки часто имеют низкую аффинность для полистирола. Необходимы другие методы для их иммобилизации, например, ковалентное присоединение с помощью глутарового альдегида. Ковалентное присоединение эффективно, если в качестве твердой фазы используются гидрофильные бусы (агароза) и полистироловые бусы.

Иммунохимические методы основываются на использовании предварительно адсорбированных «ловушечных» антител для иммобилизации антигена или антител. Антиген, иммобилизованный иммунохимически, в 10 раз активнее, чем пассивно адсорбированный антиген. Могут использоваться лектины или иммуноглобулин-связывающие белки бактерий, которые легко адсорбируются на пластике или других гидрофобных поверхностях, например конканавалин А (Кон А) или стаффилококковый белок А. Кон А способен иммобилизовать gp 120 - белок вируса ВИЧ.

Свободные сайты на поверхности твердой фазы, не связавшиеся с сорбируемым агентом, могут фиксировать в ходе теста другие молекулы, в том числе и конъюгаты, что приводит к повышению фонового сигнала. Для предотвращения неспецифического связывания после иммобилизации на твердую фазу основного материала проводят обработку нейтральными для теста веществами. Наиболее популярные блокирующие агенты - бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин и др. Выбор блокирующего агента и условия проведения этого этапа зависят от типа твердой фазы, чувствительности системы.

В настоящее время используется огромное количество всевозможных разновидностей и модификаций ИФА. Широкое распространение получили разные варианты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Твердофазный ИФА был предложен в 1971 году. Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем:

1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием.

2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В лунках с положительным контролем – стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием.

3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.

Важный этап любого варианта твердофазного анализа – процедура отмывки от несвязавшихся реагентов. Важно не просто сполоснуть фиксированные на твердой фазе компоненты, а удалить реагенты из всей глубины слоя. Это наиболее длительные и трудоемкие этапы анализа. Промывание проб может производиться в автоматическом режиме с помощью специального прибора – вошера или вручную, многоканальной пипеткой. Для проведения ИФА необходимы:

– полистироловый планшет или другие использующиеся варианты твердой фазы;

– отмывающий раствор;

– конъюгат (меченные ферментной меткой антигены или антитела);

– смесь используемых субстратов;

– останавливающий раствор (Стоп-реагент – раствор для останавливания реакции);

– образцы, использующиеся для положительного и/или отрицательного контроля;

– стандартный антиген (для построения калибровочной кривой);

– одно- и многоканальные пипетки;

– вошер (промыватель);

– оптический прибор для определения оптической плотности исследуемого раствора (ИФА-ридер, считыватель, который последовательно фотометрирует все лунки);

– 5-100 мкл исследуемого биологическою материала.

Прямой ИФА

1. В лунках панелей адсорбируют антигены или антитела (исследуемый материал). Выше отмечалось, что антигены существенно различаются по способности адсорбироваться на разных видах пластика в зависимости от того, к какому классу веществ (белкам, углеводам или липопротеинам) они принадлежат. Часто в прямом ИФА антиген, иммобилизованный на твердой фазе, это клетки и другие корпускулярные антигены.

Контроль. В качестве контроля используют лунки с адсорбированным положительным контрольным образцом, в котором обязательно содержится искомый антиген, и отрицательным контрольным образцом заведомо не содержащим исследуемого антигена. При наличии очищенного стандартного антигена реакцию проводят в нескольких разведениях, так чтобы можно было построить калибровочную кривую.

2. «Блокируют свободные места связывания, оставшиеся на твердой фазе, с помощью БСА казеина и др. (для предотвращения неспецифической сорбции конъюгата на твердой фазе).

3. В лунки вносят меченные ферментом антитела или антигены (конъюгат), инкубируют. Связывание конъюгата с твердой фазой будет происходить лишь в случае комплементарности обоих компонентов системы. После инкубации с коньюгатом лунки отмывают, удаляя, таким образом, не связавшуюся часть конъюгата.

4. Затем в лунки вносят субстрат, специфичный для используемого фермента, и инкубируют. По достижении оптимального уровня окрашивания в лунках с положительным контролем, ферментативную реакцию останавливают.

5. Учет реакции. Сначала результаты реакции учитывают визуально. Для более точного учета результатов интенсивность окрашивания оценивают на ИФА-ридере с соответствующим светофильтром. По результатам проведенного анализа строят график зависимости оптической плотносги от концетрации (рис. 2).

Рисунок 2. Прямой ИФА.

а) для выявления антигена; б) для выявления антител.

Этот вариант ИФА используют обычно для выявления специфических антител. В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген и инкубируют с образцами сыворотки или другого биологического материала, полученного от больного (спинномозговая жидкость, слюна и др.). Специфические антитела, связавшиеся с антигеном на твердой фазе, выявляют с помощью антиглобулинового конъюгата. В зависимости от цели анализа используют разные антиглобулиновые реагенты, выявляющие антитела всех изотипов, либо специфичные к отдельным классам и подклассам иммуноглобулинов. Основное достоинство метода состоит в универсальности конъюгата. Один и тот же коньюгат может служить для выявления антител человека к самым разным антигенам в любых образцах. Реакция методически проста.

Основные этапы непрямого ИФА для определения антител:

1. Антиген адсорбируют на твердой фазе, затем отмывают от несвязавшихся компонентов.

2. Блокируют свободные месга связывания. Отмывают.

3. В лунки вносят исследуемый материал, инкубируют и затем проводят процедуру отмывки. Параллельно ставят пробы с положительным и отрицательным контролями.

4. Добавляют антиглобулиновый конъюгат в рабочем разведении, инкубируют, отмывают от несвязавшихся компонентов.

5. Вносят субстрат, инкубируют. По достижении оптимального уровня окрашивания в лунках с положительным контролем реакцию останавливают, добавляя стоп-раствор.

6. Измеряют количество продукта реакции на ИФА-ридере (рис.3).

При оптимальных условиях проведения анализа метод высокоспецифичен и чувствителен. Он позволяет выявлять нанограммовые количества антител в сыворотках исследуемых больных. Для получения удовлетворительных результатов необходима стандартизация реагентов и методических приемов. Этот вариант ИФА может также использоваться для тестирования моноклональных антител.

Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повторяющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфичности.

При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все остальные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.

Основные этапы анализа:

1. На твердой фазе иммобилизуют моноклональные антитела или аффинно-очищенные поликлональные антитела.

2. В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положительный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различных разведениях. Инкубируют и отмывают.

3. В лунки вносят меченные ферментом моноклональные или поликлональные антитела – конъюгат. После инкубации проводят отмывку.

4. Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем.

5. Учет результатов на ИФА-ридере.

Основным достоинством метода является высокая чувствительность, превосходящая возможности других схем ИФА (рис.4).

Рисунок 3. Непрямой ИФА для выявления антител.

Этот вариант анализа основан на конкуренции меченых (конъюгат) и немеченых (исследуемых) антител за связывание с антигеном, адсорбированным на твердой фазе. Количество фермента, присоединившегося к твердой фазе, уменьшится пропорционально содержанию в смеси свободных антител. Для определения антигена используется тот же вариант, но в этом случае искомый антиген конкурирует с меченым, стандартным антигеном за связывание с антителами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы.

Конкурентный метод требует минимального числа операций, незначительного расхода реагентов и легко может бытъ автоматизирован. При проведении конкурентного ИФА для выявления антител лучше использовать меченые моноклинальные антитела, тогда конкуренция конъюгата с исследуемым образцом происходит за единственный эпитоп адсорбированного на твердой фазе антигена. Этот вариант ИФА применяется для определения различных соединений, таких как иммуноглобулины человека, раково-эмбриональный антиген, инсулин и др. Он позволяет выявлять антитела к диагностически значимым эпитопам инфекционных агентов.

Основные этапы анализа для выявления антигена (рис.5):

1. На твердой фазе иммобилизуют специфические для выявляемого антигена моноклональные антитела.

2. В лунки панелей вносят в известной концентрации антиген, меченный ферментом, и исследуемый образец. Проводят инкубацию и отмывку. Параллельно в соседних лунках ставят положительный и отрицательный контроли. Для построения калибровки используют стандартный немеченый антиген в различных разведениях.

3. Добавляют субстрат, инкубируют, останавливают реакцию при развитии оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем.

4. Учет реакции на ИФА-ридере.

В этом случае количество антигена в исследуемом образце обратно пропорционально ферментативной активности на твердой фазе.

В этом варианте ИФА антиген, присутствующий в исследуемом образце, связывается с моноклональными антителами, меченными ферментной меткой, и ингибирует их взаимодействие со стандартным антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. Присутствие в образце даже следовых количеств специфичного к конъюгату антигена будет ингибировать связывание меченых антител с иммобилизованным антигеном. Степень ингибирования прямо пропорциональна содержанию антигена в растворе. Для проведения количественного анализа строят кали6ровочную кривую с помощью последовательных разведений стандартного антигена. Основные этапы ингибиторного ИФА для выявления антигена (рис.6).

1. В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген. Подбирают рабочее разведение меченых антител с помощью титрования.

Рисунок 4. «Сэндвич»- вариант ИФА.

2. Проводят предварительную инкубацию конъюгата в разведении, предшествующем рабочему, с разведениями исследуемого образца, стандартного антигена и положительных контрольных проб.

3. Смесь переносят в лунки панелей. Для контроля 100%-ного связывания в несколько лунок вносят только меченые антитела, без ингибирующего антигена. Панели инкубируют, затем проводят отмывку.

4. Добавляют субстрат.

5. Проводят учет результатов.

Концентрация определяемого антигена в исследуемом образце обратно пропорциональна ферментативной активности на твердой фазе.

ИФА может использоваться не только для определения растворимого антигена или антитела, но и клеток, вырабатывающих различные белки.

В 1983 году адаптировали технологию твердофазного ИФА для определения лимфоидных клеток, секретирующих антитела или антигены (например, цитокины), in vitro. Метод получил название ELISPOT (метод иммуноферментных зон или пятен). Основной принцип метода:

1. На поверхности полистироловой лунки (используют 24-х луночные панели для культивирования клеток) сорбируют антигены или антитела, которые служат «ловушечными» реагентами.

2. Добавляют исследуемые лимфоидные клетки, культивируют несколько часов при 37°С, давая им возможность занять определенное место и выполнить секреторную функцию. Антитела или антигены, секретируемые такими клетками, улавливаются адсорбированными на твердой фазе реагентами.

3. Клетки удаляют, используя для этого отмывающий раствор с детергентом, лизирующим клетки.

4. Участки накопления секреторных продуктов проявляют, добавляя связанные с ферментом антитела (антиглобулиновый реагент).

5. Добавляют смесь субстрата с агарозой (используемые субстраты должны растворяться в агарозе и образовывать нерастворимые продукты реакции), на поверхности твердой фазы образуются коричневые или голубые пятна (в зависимости от используемых ферментов и субстратов), выявляя участки, где располагались клетки.

Образовавшиеся пятна подсчитывают под микроскопом, это и будет количество секретирующих клеток.

В качестве твердой фазы может быть использована нитроцеллюлозная мембрана В этом случае есть ряд преимуществ: из-за высокой адсорбционной способности НЦМ требуется значительно меньшее количество антигена, используемого в качестве «ловушечного» реагента, кроме того, отпадает необходимость во включении агарозы в субстрат.

При параллельном определении количества секретирующих клеток и общего количества секретируемого антигена или антитела в лунке, что возможно при использовании другого субстрата, можно выявить количество секретируемого вещества единичной клеткой.

Данный метод нашел широкое применение для оценки количества клеток, секретирующих антиген, улавливаемый адсорбированными антителами, используется для определения количества клеток, секретирующих цитокины (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИФН-у, ФНО-а).

При использовании высокоаффинных антител чувствительность отдельных вариантов ИФА очень высока и теоретически позволяет выявить единичные молекулы антигена, но на практике чувствительность ограничивается рядом факторов: активностью фермента, интенсивностью сигнала и методами учета сигнала. Системы усиления сигнала дают возможность повышать чувствительность различных вариантов ИФА. Рассмотрим некоторые такие системы:

На основе взаимодействия авидин-биотин.

Молекулы кофермента биотина (м.м. 244 Да) конъюгируют с антителами при помощи биотинил-N-гидроксисукцимида. Небольших размеров молекулу биотина проще присоединить к иммуноглобулину или другому белку без нарушения его иммунных или ферментативных свойств. Фермент в этом случае связывают с гликопротеином яичного белка авидином. Аффинносгь связывания авидина с биотином очень высока (константа диссоциации комплекса – 10-15 моль), конъюгат авидин-фермент прочно фиксируется на комплексе антиген-антитело-биотин. После добавления соответствующего субстрата проводят определение продукта реакции спектрофотометрически или по интенсивности люминесценции.

Одна молекула авидина состоит из четырех идентичных субъединиц, способна взаимодействовать с четырьмя молекулами биотина, что позволяет использовать его как связующую молекулу между двумя биотинсодержащими соединениями. В этом случае фермент тоже биотинилируют, а авидин выполняет функцию мостика, соединяя две молекулы, содержащие остатки биотина. К образовавшемуся комплексу антиген-антитело-биотин добавляют свободный авидин, а затем биотинилированный фермент. Проводят учет реакции.

Белок авидин может неспецифически сорбироваться на других молекулах, поэтому все чаще используют другой биотинсвязывающий белок - стрептавидин, обнаруженный в бактериях Streptomyces avidinii. Стрептавидин также образует прочный комплекс с биотином и состоит из четырех идентичных субъединиц.

Применение авидин-биотинового комплекса позволяет значительно повысить чувствительность ИФА, так как при синтезе конъюгата с одной молекулой АТ можно связать десятки молекул биотина. Получение конъюгатов (антител и ферментов с биотином) осуществляется достаточно легко и сопровождается минимальными изменениями их иммунологической и ферментативной активности. Конъюгаты ферментов с биотином могут быть использованы как универсальные реагенты.

Использование хемилюминесцентных реакций.

Хемилюминесцентные реакции можно использовать для получения сигнала в ИФА, при этом повышается чувствительность метода и сокращается время проведения анализа. В качестве метки в ИФА широко применяют пероксидазу хрена, для ее выявления можно использовать и различные хемилюминесцентные реакции. Хемилюминесцентные реакции основаны на способности люминола светиться при окислении перекисью водорода. В прямом анализе при ферментативной реакции образуется перекись водорода и окисляет люминол, катализатором этой реакции выступает пероксидаза хрена. Для усиления сигнала используются различные соединения, например, люциферин, фенолы, в этом случае интенсивность люминесценции усиливается в 10-100 раз, в отдельных вариантах в 500 раз (усиленный хемилюминесцентный анализ). Люминесцентный сигнал очень стабилен, его уровень достигает максимума за 30 с (для сравнения: цветная реакция с ОФД в качестве индикатора полностью развивается лишь за 30 мин).

При непрямом анализе люминолом или его производными метится антитело. Такая метка в свободном состоянии способна окисляться перекисью водорода с выделением света. Если она образовала комплекс, то теряет способность окисляться.

На основе каскадных систем.

Для повышения чувствительности ИФА можно использовать ферментные каскадные системы. В этом случае первый фермент, связанный с антителами, приводит к образованию восстанавливаемого субстрата для второй ферментной системы. Вторая ферментная система может быть субстрат-циклической или редоксициклической. Ферментными метками в этом случае могут служить фосфо-глюкоизомераза, альдолаза, щелочная фосфатаза. Конечный продукт реакции определяют визуально или спектрофотометрически.

Системы амплификации в ИФА позволяют добиться высокой чувствительности. Такие ИФА-системы используются для определения уровня гормонов (ти-реостимулирующего, прогестерона и др.).

ИФА нашел широкое применение в различных областях медицины и биологии благодаря относительной простоте и высокой чувствительности метода. ИФА успешно применяется для:

Массовой диагностики инфекционных заболеваний (выявление различных специфических антигенов или антител к ним);

Выявления и определения уровня гормонов и лекарственных препаратов в биологических образцах;

Определения изотипов (IgG, IgM и другие) антител против конкретного антигена;

Выявления иммунных комплексов;

Выявления онкомаркеров;

Определения белков сыворотки крови (ферритин, фибронектин и др.);

Определения общего IgE и специфических IgE антител;

Скрининга моиоклональных антител;

Определения цитокинов в биологических жидкостях.

Чувствительность метода

ИФА пришел на смену широко используемым ранее в клинической практике методам агглютинации, преципитации и РИА. По сравнению с вышеназванными методами ИФА менее трудоемок и менее продолжителен по времени, удобен для выполнения большого числа однотипных анализов.

В ИФА сочетается уникальная специфичность иммунохимического анализа с высокой чувствительностью определения ферментной метки. Чувствительность метода (под чувствительностью подразумевают минимальное выявляемое количество антител или антигена) определяется следующими факторами: аффинностью антител, предпочтительнее использование моноклональных антител; специфической активностью фермента; интенсивностью сигнала; чувствительностью учета сигнала. Различные варианты ИФА различаются по своей чувствительности. Отдельные варианты твердофазного ИФА позволяют выявлять в образце единичные молекулы. Средняя чувствительность ИФА – 10-9 – 10-12 моль.

Галактионов В.Г. Иммунология. Издательство Московского университета, 1998 г.

Кишкун А.А. Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике. Медицинское информационное агентство, 2009 г.

Кондратьева И.А. Практикум по иммунологии. Учебное пособие для ВУЗов. Академия, 2004 г.

Лефковитс И., Пернис Б. Иммунологические методы исследования. Мир, 1988 г.

Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. Мир, 2000 г.

Соколов Е.И. Клиническая иммунология. Медицина, 1998 г.

Фримель Г. Иммунологические методы. Медицина, 1987 г.

Хаитов Р. М. Иммунология. Медицина, 2000 г.

Шигина Ю.В. Иммунология: Учебное пособие. Издательство РИОР, 2007 г.

Ярилин А.А. Основы иммунологии. Медицина, 1999 г.

В перечень стандартных диагностических мероприятий, применяемых для инфекционных заболеваний, входит иммуноферментный анализ. Если ИФА на сифилис положительный, не стоит сразу впадать в панику.

Рассмотрим подробнее особенности этой методики исследования и принципы расшифровки полученных результатов у разных категорий пациентов.

Иммуноферментный анализ является одним из наиболее распространенных методов диагностики инфекционных заболеваний. Он относится к категории трепонемных тестов, то есть с его помощью можно установить наличие в организме пациента возбудителя сифилиса – бледной трепонемы.

Методом ИФА сифилис обнаруживается благодаря выявлению антител к трепонеме. Они содержаться в крови больного, причем их тип и количество зависят от стадии и формы заболевания, что позволяет получить важную информацию о текущем состоянии здоровья человека.

Преимущества и недостатки

ИФА очень часто назначается при подозрении на сифилис или другие инфекционные заболевания. Это обусловлено тем, что анализ позволяет выявить точный тип и стадию заболевания, причем его достоверность сохраняется на высоком уровне – вероятность ошибки по итогам многократного исследования составляет всего 1%, первичный ИФА имеет точность около 90%.

Использование качественных реактивов и современного оборудования позволяет максимизировать точность показателей.

В целом преимуществами метода являются:

1. Высокая точность результата . Вероятность получения ложных данных очень мала.
2. Минимизация человеческого фактора влияния. Современное оборудование для проведения ИФА исключает влияние человека на итоги исследования за счет автоматизации процесса.
3. Выявление конкретных антител . Спутать антигены одного вида с другими невозможно, поэтому анализ показывает точный результат по конкретному диагнозу.
4. Фиксация малейших отклонений от нормы . Даже самая незначительная концентрация патологических агентов не останется без внимания.

Не стоит забывать и о слабых сторонах этого метода. ИФА обладает следующими недостатками:

1. Высокая цена. Высокая стоимость обусловлена многими факторами, в частности, необходимостью хорошего оборудования, качественных реагентов и специалистов с достаточным уровнем подготовки.
2. Необходимость постановки предварительного диагноза. Нужно знать какие именно антигены искать, так как без дополнительных данных поставить точный диагноз будет невозможно.
3. Вероятность ложноположительного результата. Некоторые состояния организма и прочие факторы могут исказить итоговые данные.

Показания к проведению

Врач может назначить проведение иммуноферментного анализа для диагностики не только сифилиса, но и ряда других инфекционных заболеваний.

Если рассматривать ситуацию непосредственно с заражением трепонемой, поводом для обследования могут стать:

• появление внешних симптомов заболевания (шанкры, сифилитическая сыпь, гуммы и т.д.);
• существенное понижение иммунитета;
• выявление или подозрение на сифилис у полового партнера, близких и членов семьи;
• положительная реакция при проведении других тестов;
• выявление других заболеваний, которые могут быть связаны с сифилисом;
• личное пожелание человека пройти обследование.

Способы проведения

ИФА может проводиться разными способами. В каждом конкретном случае подбирается наиболее подходящий вариант.

В первую очередь, существует разделение методов на:

1. Качественный. Выявляется наличие инфекции или вируса в организме пациента.
2. Количественный. Определяет концентрацию антител к патогенному агенту в организме человека, что указывает на стадию и интенсивность развития заболевания.

Также существует классификация способов проведения ИФА по принципу воспроизведения необходимой реакции.

Различают 3 варианта:

1. Прямой . Меченные антитела вводятся в предоставленные образцы крови.
2. Непрямой с антигенами. Предварительно производится размещение сорбированных антигенов в ячейки полистирольного планшета, предназначенного для проведения ИФА. Затем к ним добавляются антитела вирусов, что провоцирует образование иммунных комплексов, необходимых для дальнейшей оценки результатов.
3. Непрямой с антителами. Для венерических заболеваний часто используется именно этот способ. Он предполагает предварительное сорбирование антител, лишь затем на планшет добавляют антигены.

Правила забора материала

Для того чтобы сократить риски получения недостоверных результатов, необходимо правильно сдать кровь для анализа.

Перед прохождением ИФА нужно соблюдать некоторые ограничения:

• избегать интенсивных физических и эмоциональных нагрузок;
• отказаться от курения и приема алкоголя минимум за 1 — 3 дня;
• на несколько дней нужно перейти на правильное питание;
• женщинам желательно контролировать фазу менструального цикла, так как гормоны способны исказить результаты;
• последний прием пищи должен быть за 8 — 10 часов до сдачи крови;
• за 10 дней исключается прием лекарств, которые могут повлиять на результаты исследования.

Для ИФА берется венозная кровь из локтевой вены, сдавать ее нужно утром натощак. В целом применяются стандартные правила подготовки к забору венозной крови. В зависимости от того наличие какого заболевания тестируется, могут вноситься дополнительные требования к предварительной подготовке пациента.

Методика проведения

Инструкция по проведению ИФА достаточно проста:

1. У пациента берется кровь из вены.
2. Взятый материал проходит подготовку и разделяется на пробы на специальной мелкоячеистой палетке.
3. Проводится смешивание антигенов с антителами по выбранной методике.
4. Оценивается реакция. Пробы сравниваются с контрольными образцами, производится качественная и количественная оценка результатов.
5. Данные заносятся в специальную таблицу с приложением количественных показателей (суммарные антитела).
6. Лечащим врачом производится расшифровка результатов. При необходимости назначается соответствующее лечение.

После проведения исследований пациенту выдается документ с результатами. Он имеет вид таблицы с соответствующими обозначениями напротив каждого типа иммуноглобулина на пересечении с наименованиями инфекционных заболеваний.

Расшифровка

Только специалист сможет грамотно расшифровать результаты анализов. Самостоятельно трудно разобраться, например, что означает результат ИФА к=1 4. Сифилис к тому же может протекать в разных формах, что также отражается на итоговых данных.

В результатах указываются 3 вида иммуноглобулинов:

1. IgM . Позволяют определить срок заражения сифилисом. Положительный результат свидетельствует об обострении заболевания. Их отсутствие может указывать на ремиссию хронических патологий или скрытую форму болезни.
2. IgA. Указывает на заболевание, с момента заражения которым прошло больше месяца. Также является признаком острой фазы болезни, причем как при обычных патологиях, так и запущенных хронических.
3. IgG . Является признаком пикового периода заболевания, то есть его обострение. При сифилисе положительная реакция проявляется некоторое время после прохождения лечения. При некоторых видах заболеваний может быть признаком выработанного иммунитета.

Эти вещества вырабатываются организмом в определенной последовательности, что является дополнительным признаком болезни. При качественных тестах устанавливается лишь присутствие иммуноглобулинов в крови каждого типа.

Это выражается в изменении цвета материалов, участвующих в анализе. Количественные показатели являются вспомогательными, они более точно описывают ситуацию. Соотношение антигенов и антител указывает на степень тяжести заболевания и интенсивность ответных действий организма.

Что делать

Если у пациента действительно имеется сифилис, положительный ИФА обнаруживается абсолютно всегда, не заметить присутствия трепонем при таком исследовании невозможно. Не стоит отчаиваться, заболевание хорошо поддается лечению, особенно на начальных стадиях.

Что необходимо делать при положительных результатах теста:

• по показаниям врача пройдите дополнительные обследования;
• пройдите курс антибиотикотерапии по выбранной схеме;
• направьте усилия на укрепление иммунитета;
• сообщите о заболевании своему половому партнеру;
• в дальнейшем регулярно проходите профилактическую диагностику до момента снятия с учета в диспансере (через 5 лет при отсутствии положительных результатов анализов).

Не нужно откладывать уход на больничный и бояться огласки результатов. Диагноз шифруется и остается в секрете, лишь при угрозе инфицирования других людей необходимо сообщить о проблеме родственникам и половому партнеру, чтобы они прошли требуемые обследования.

Ложноположительный результат и его причины

Иногда фиксируется результат других тестов и ИФА ложноположительный на сифилис. Именно поэтому рекомендуется проводить 2 — 3 вспомогательных метода и через некоторое время повторять иммуноферментный анализ.

Подобные неточности встречаются редко, они обусловлены преимущественно такими факторами:

• беременность;
• хронические заболевания;
• недавняя вакцинация;
• травмы.

Ложноположительные результаты разделяют на острые и хронические, в зависимости от характера спровоцировавшего их фактора.

Основные из них представлены в таблице:

При наличии подобных проблем со здоровьем тест на сифилис может показать положительный результат, но это является лишь следствием выработки организмом белков для борьбы с заболеванием. Однако ИФА распознает их, как антигены.

У здорового ребенка до полуторагодовалого возраста могут наблюдаться ложноположительные результаты ИФА, если женщина во время беременности была инфицирована сифилисом. До этого возраста кровь еще не успевает полностью обновиться, поэтому в ней могут присутствовать антитела матери. Исключение составляет ситуация с обнаружением иммуноглобулинов IgM.

Больше информации об особенностях иммуноферментного анализа и методике его проведения вы можете узнать, посмотрев видео в этой статье.