Что происходит с образцами крови, которую вы сдаете на клинический анализ? Сколько весит ваш гемоглобин? Каким образом ученые вообще взвешивают молекулы - мельчайшие частицы вещества, которые невозможно увидеть или потрогать? Обо всем этом в рамках рубрики «Просто о сложном» T&P рассказала студентка 5-го курса кафедры химической физики ФМХФ, сотрудница лаборатории ионной и молекулярной физики МФТИ Екатерина Жданова.

Очень часто методы исследований интересуют лишь специалистов в конкретных областях и остаются в тени более фундаментальных проблем, например происхождения жизни или принципов работы человеческого сознания. Тем не менее для поиска ответа на «главный вопрос жизни, Вселенной и всего остального» сначала необходимо научиться отвечать на вопросы более простые. Например, как взвесить молекулу? 

Обычные весы тут вряд ли помогут: масса молекулы метана - около 10^(-23) грамм. Молекула гемоглобина, крупного и сложного белка, весит в несколько раз больше - 10^(-20) грамм. Ясно, что необходим какой-то иной подход к проблеме, ведь привычные нам измерительные приборы к ней не применимы. Надо также понимать, что, взвешивая в магазине яблоки или становясь на весы после тренировок, мы на самом деле измеряем силу, действующую на прибор - весы. Затем уже происходит пересчет в привычные нам единицы - граммы и килограммы.


Но как же взвесить молекулу? Здесь природа оставила нам лазейку. Оказывается, заряженные частицы «чувствуют» присутствие электрического и магнитного поля и изменяют траекторию и характер своего движения. На заряженные частицы также действуют силы, величину которых можно пересчитать в отношении массы к заряду.
Этот метод сегодня довольно популярен и называется масс-спектрометрия. Первооткрывателем масс-спектрометрии считается сэр Дж. Дж. Томсон, нобелевский лауреат по физике. Он обратил внимание на то, что заряженные частицы движутся в магнитном поле по параболическим траекториям, пропорциональным отношению их массы к заряду.

Схема работы масс-спектрометра состоит из нескольких этапов. Прежде всего анализируемое вещество должно пройти ионизацию. Затем оно попадает в систему ионного транспорта, которая должна доставить заряженные частицы в масс-анализатор. В масс-анализаторе как раз происходит разделение ионов в зависимости от отношения массы к заряду. В завершение ионы попадают на детектор, данные с которого анализируются с помощью специального программного обеспечения. Полученная таким образом картинка представляет собой спектр, то есть распределение частиц. Одна из осей этого графика - отношения массы к заряду, вторая - интенсивность. Каждый из пиков на таком графике будет характерным для ионов конкретного вещества, поэтому попадание в прибор посторонних веществ, например воздуха, может привести к искажениям результатов. Чтобы избежать этого, применяется вакуумная система.

Сравнительно простая физическая концепция данного метода требует ряда нетривиальных инженерных решений. Как ионизировать молекулы? Каким способом создавать электромагнитное поле? 
Атомы и молекулы электрически нейтральны, поэтому для проведения масс-спектрометрических измерений необходимо их ионизировать, то есть оторвать электроны с внешних атомных орбиталей или добавить протон. Важную роль играет тип образца, с которым предстоит работать. Для исследования неорганических веществ - металлов, сплавов, горных пород - необходимо использовать одни методы, для органических веществ подходят другие. Очень многие органические вещества (такие как ДНК или полимеры) сложно испарить, то есть перевести в газ, без разложения, а это значит, что исследования живой ткани или биологических образцов требуют применения специальных методов. Кроме того, при ионизации молекулы могут распадаться на отдельные фрагменты. Так мы снова встаем перед вопросом: что именно мы собираемся измерить? Массу всей молекулы или массу фрагментов? И то и другое важно. Более того, измерив массу целой молекулы, исследователи часто специально дробят ее на куски. Так, определив массу структурных элементов белка, мы вместе с тем определяем и их количество, что позволяет нам делать выводы о его химическом составе и структуре.

Все это говорит о разнообразии существующих масс-спектрометров, каждый из которых применяется для решения задач в конкретной области. Этот метод практически незаменим в тех случаях, когда ученым необходимо определить химический состав вещества. Фармацевты применяют масс-спектрометрические эксперименты при разработке лекарств, исследованиях фармакокинетики (то есть биохимических процессов, происходящих в организме при принятии лекарства) и метаболизма. Ученые-биологи используют масс-спектрометрию для анализа белков, пептидов и нуклеиновых кислот. Кроме того, если мы хотим проверить качество воды или продуктов питания, то нам снова не обойтись без этого метода.

Отдельная инновационная область применения масс-спектрометрии - медицинская диагностика. К развитию множества заболеваний приводят структурные изменения белков нашего организма: обычно они классифицируются по образованию характерного кусочка, пептида-маркера. Если вовремя определить такую мутацию, то появляется возможность лечить болезнь на ранней стадии. Кроме того, благодаря современным масс-спектрометрам становится возможным проводить исследования такого рода в режиме реального времени - например, в ходе нейрохирургической операции. Это позволяет точно определять границы между здоровой тканью и опухолью, что критически важно для хирургов.

Кажущаяся на первый взгляд сухой и узкопрофильной, масс-спектрометрия при внимательном ознакомлении оказывается удивительно богатой областью, объединяющей широкий класс приложений с необычными инженерными решениями. Наука показывает, что ответы на менее фундаментальные вопросы порой не менее интересны.

Масс-спектрометр – устройство для установления масс атомов (молекул) согласно характеру перемещения их ионов в гальваническом и магнитном фонах.

Навигация:

Нейтральная частица не подвергается воздействию гальванического и магнитного поля. Тем не менее, в случае если забрать у неё либо прибавить ей один и больше электронов, в таком случае она перевоплотится в ион, вид перемещения которого в данных полях достаточно предопределяется его весом и зарядом. Определённо говоря, в масс-спектрометрах обусловливается не масса, а расположение массы к заряду. В случае если запас известный, в таком случае несомненно обусловливается массовая значимость иона, а следовательно, масса промежуточного атома и его ядра. Конструктивно, масс-спектрометры могут очень различаться друг от друга. В них могут применяться равно как статичные поля, так и меняющиеся во времени поля, магнитные либо гальванические.

Масс-спектрометр складывается с последующих ключевых элементов:

• Гетерополярного источника, где промежуточные атомы преобразуются в ионы (к примеру, перед воздействием нагревания либо СВЧ-поля) и убыстряются гальваническим полем;
• Сферы неизменных электро- и магнитных полей;
• Приёмника ионов, характеризующего местоположение областей, куда определяются ионы, пересекшие данные поля.

Масс-спектрометр

Хромато-масс-спектрометр

Концепция ХМС с комбинированным квадруполь-времяпролётным масс-спектрометром высокого разрешения с ионизацией электроспреем, дает возможность замечать и определять как ведомые компоновки и их метаболиты, так и незнакомые компоновки в размашистом спектре масс с 20 вплоть до 40 000. Несомненно (лекарственные вещества, наркотикосодержащие вещества, пестициды и др.), осуществлять совместное исследование главных и следовых частей, предопределять подлинное изотопическое отношение с целью четкого установления молекулярных формул. Меняющийся интервал при численной оценке является свыше 4 порядков. Применяется с целью численной оценки синтезов. Устройство располагает уникальными характеристиками: разрешающей возможностью более 35 000 FWHM, правильностью установления молекулярной массы меньше 0.7 ррm, высочайшей чувствительностью при наибольшем разрешении. Большой темп распознавания информации – вплоть до 60 спектров в одну секунду.

Хромато-масс-спектрометр

Научные работники в течение длительного времени разыскивали альтернативу магниту в свойстве масс-анализатора. В 1953 Вольфгангом Паулем, в дальнейшем получивший Нобелевскую премию в области физики в 1989 г., было очерчено первое устройство с квадрупольным анализатором. Формирование квадрупольных масс-анализаторов стало революцией в масс-спектрометрии. Магнитные масс-анализаторы требуют применения высочайших напряжений (тыс. вольт), а квадрупольные - нет, и данное упрощает их систему, наименьшие объемы вакуумной доли упрощают концепцию формирования вакуума. Масс-спектрометры стали меньше в объемах, стали легче в эксплуатации и что самое главное, гораздо экономичнее, чтобы раскрыть вероятность пользоваться данным аналитическим способом многочисленным тысячам пользователей. К минусам квадруполей принадлежат невысокое разрешение и небольшой верх наибольшей детектируемой массы (м/z~4100). Тем не менее, нынешние масс-анализаторы дают возможность осуществлять детектирование ионов с соответствием м/z~350.

Принцип действия

Квадруполь предполагает собою 4 одновременно и симметрично размещенных монополя (электроды совершенного сечения). К электродам по двое в обратной полярности подаётся обусловленное сочетание непрерывного и индукционного напряжения.

Под воздействием незначительного убыстряющего напряжения (15-25 В), ионы входят синхронно осям стержней электродов. Перед воздействием осцилирующего поля, предопределяемым электродами, они начинают двигаться вдоль осей х и у. При этом амплитуда колебаний увеличивается без перемены направленности перемещения. Ионы, чьи амплитуды доходят высочайших значимостей, нейтрализуются при столкновении с электродами. Прочную амплитуду обретают только лишь эти ионы, чьи значения м/z станут отвечать установленному соответствию U/V. Последнее дает возможность им беспрепятственно передвигаться в квадруполе и находиться в окончательном результате детектируемыми. Подобным способом, масс-диапазон фиксируется маршрутом обоюдной перемены значимостей величин U и V.

Квадрупольный масс-спектрометр

Магнитный масс-спектрометр

В магнитных масс-спектрометрах с целью распределения ионов в масс-анализаторах, применяют гомогенное магнитное поле. В данном случае движения форсирования ионов в гальванической область и распределения их в магнитной, могут быть изображены численно.

Магнитный масс-термоанализатор - приспособление с целью пространственного и временного распределения ионов с разными значимостями взаимоотношения массы к заряду, применяющиеся с целью распределения магнитного поля.

Исторически, первоначальным масс-анализатором был магнит. В соответствии с физическим законом, линия заряженных элементов в магнитном поле искажается, а радиус кривизны находится в зависимости от массы элементов.

Существуют разные геометрии магнитных масс-анализаторов, в каковых измеряется или радиус кривизны, или магнитное поле. Магнитные масс-спектрометры обладают высочайшим разрешением и могут применяться с абсолютно всеми типами ионизации. Невзирая на существенные плюсы нынешних пред остальными (высочайшее разрешение, большая достоверность замеров и высокий рабочий интервал масс), они располагают 2-я главными недостатками - данное оборудование огромно, как согласно объемам, так и согласно размеру цены.

Магнитный масс-спектрометр

Это простой тип масс-анализатора. Во времяпролетном масс-анализаторе ионы выпадают с источника и оказываются во времяпролетной трубе, где не имеется гальванического поля (бесполевой период). Пронесшись определенный промежуток d, ионы фиксируются сенсором ионов с прямой либо практически прямой фиксирующей поверхностью. В 1951-1971 годах, в свойстве сенсора ионов применялся второстепенный электрический умножитель «жалюзного типа», позднее использовался составной обнаружитель, применяющий 2 либо изредка 3 последовательно находящихся микроканальных пластинок.

Времяпролетный масс-термоанализатор представляется пульсирующим масс-анализатором, то есть ионы зачисляются с источника ионов во времяпролетный элемент не постоянно, а дозами, при помощи определенных интервалов времени. Подобные масс-анализаторы совместимы с ионизацией лазерной десорбции, при содействии матрицы, таким образом, как в этом способе ионизации, ионы кроме того возникают не постоянно, а при любом импульсе лазера.

Времяпролетный масс-спектрометр

Масс-спектрометры Agilent

Еще издавна масс-спектрометр оценивают как прекрасный обнаружитель для газовой хроматографии. Приобретенные с поддержкой масс-спектрометрического сенсора спектры, предоставляют подобные сведения о высококачественном составе проверки, которую не могут предоставить другие газохроматографические сенсоры. Масс-спектрометрический обнаружитель имеет огромную чувствительность, помимо этого, он уничтожает пробу, предоставляет данные о массе и распознаёт быстрее гомологи, нежели изомеры.

Высоконадежные масс-спектрометры Agilent удовлетворяют наиболее большим условиям и предельно отвечают решаемым задачам. В настоящий период производители могут представить линейки высокоточных прогрессивных масс-спектрометров для ГX и BЭЖX.

Масс-спектрометр Agilent

Получения и интерпретации масс-спектров, которые в свою очередь получаются при помощи масс-спектрометров .

В органических веществах молекулы представляют собой определённые структуры, образованные атомами. Природа и человек создали поистине неисчислимое многообразие органических соединений. Современные масс-спектрометры способны фрагментировать детектируемые ионы и определять массу полученных фрагментов. Таким образом, можно получать данные о структуре вещества.

История масс-спектрометрии

• 1912 год - Томсон создает первый масс-спектрограф и получает масс-спектры молекул кислорода , азота , угарного газа , углекислого газа и фосгена .

• 1913 год - С помощью своего масс-спектрографа Томсон открывает изотопы неона : неон-20 и неон-22.

• 1923 год - Астон измеряет с помощью масс-спектрометра дефект массы .

• 1934 год - Конрад применяет масс-спектрометрию для анализа органических молекул.

• 1940 год - Нир с помощью препаративной масс-спектрометрии выделяет уран-235 .

• 1940 год - Нир создает первый надежный источник электронного удара, применив ионизационную камеру .

• 1948 год - Камероном и Эггером создан первый масс-спектрометр с время-пролётным масс-анализатором .

• 1953 год - Пауль патентует квадрупольный масс-анализатор и ионную ловушку .

• 1956 год - МакЛаферти и Голке создают первый газовый хромато-масс-спектрометр.

• 1966 год - Мансон и Филд создают ионный источник с химической ионизацией .

• 1972 год - Каратаев и Мамырин изобретают время-пролётный масс-анализатор с фокусировкой, значительно улучшающий разрешение анализатора.

• 1974 год - Первый жидкостный хромато-масс-спектрометр создан Арпино, Болдуином и МакЛаферти

• 1981 год - Барбер, Бордоли, Седжвик и Тайлор создают ионизатор с бомбардировкой быстрыми атомами (FAB).

• 1982 год - Первый масс-спектр целого белка (инсулин) с помощью бомбардировки быстрыми атомами (FAB).

• 1983 год - Бланки и Бестал изобретают термоспрей .

• 1987 год - Карас, Бахман, Бар и Хилленкамп изобретают ионизацию лазерной десорбцией при содействии матрицы (MALDI).

• 1999 год - Александр Макаров изобретает электростатическую ионную ловушку.

Принцип работы и устройство масс-спектрометра

Источники ионов

Первое, что надо сделать для того, чтобы получить масс-спектр, - превратить нейтральные молекулы и атомы, составляющие любое органическое или неорганическое вещество, в заряженные частицы - ионы . Этот процесс называется ионизацией и по-разному осуществляется для органических и неорганических веществ. Вторым необходимым условием является перевод ионов в газовую фазу в вакуумной части масс спектрометра. Глубокий вакуум обеспечивает беспрепятственное движение ионов внутри масс-спектрометра, а при его отсутствии ионы рассеются и рекомбинируют (превратятся обратно в незаряженные частицы).

Условно способы ионизации органических веществ можно классифицировать по фазам, в которых находятся вещества перед ионизацией.

Газовая фаза Жидкая фаза

• ионизация при атмосферном давлении (AP)

В неорганической химии для анализа элементного состава применяются жёсткие методы ионизации, так как энергии связи атомов в твёрдом теле гораздо больше и значительно более жёсткие методы необходимо использовать для того, чтобы разорвать эти связи и получить ионы.

• ионизация в индуктивно-связанной плазме (ICP)
• термоионизация или поверхностная ионизация
• ионизация в тлеющем разряде и искровая ионизация (см. искровой разряд)
• ионизация в процессе лазерной абляции

Масс-анализаторы

Полученные при ионизации ионы с помощью электрического поля переносятся в масс-анализатор. Там начинается второй этап масс- спектрометрического анализа - сортировка ионов по массам (точнее по отношению массы к заряду, или m/z). Существуют следующие типы масс-анализаторов:

Непрерывные масс-анализаторы

• Магнитный и электростатический секторный масс-анализатор (англ. Sector instrument )
• Квадрупольный масс-анализатор (англ. Quadrupole mass analyzer )

• Времяпролётный масс-анализатор (англ. Time-of-flight mass spectrometry )
• Ионная ловушка (англ. Ion trap )
• Квадрупольная линейная ловушка (англ. Quadrupole ion trap )
• Масс-анализатор ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (англ. Fourier transform ion cyclotron resonance )
• Орбитрэп (англ. Orbitrap )

Разница между непрерывными и импульсными масс-анализаторами заключается в том, что в первые ионы поступают непрерывным потоком, а во вторые - порциями, через определённые интервалы времени.

Масс-спектрометр может иметь два масс-анализатора. Такой масс-спектрометр называют тандемным . Тандемные масс спектрометры применяются, как правило, вместе с «мягкими» методами ионизации, при которых не происходит фрагментации ионов анализируемых молекул (молекулярных ионов). Таким образом первый масс-анализатор анализирует молекулярные ионы. Покидая первый масс-анализатор, молекулярные ионы фрагментируются под действием соударений с молекулами инертного газа или излучения лазера, после чего их фрагменты анализируются во втором масс-анализаторе. Наиболее распространёнными конфигурациями тандемных масс спектрометров являются квадруполь-квадрупольная и квадруполь-времяпролётная.

Детекторы

Итак, последним элементом описываемого нами упрощённого масс-спектрометра, является детектор заряженных частиц. Первые масс-спектрометры использовали в качестве детектора фотопластинку. Сейчас используются динодные вторично-электронные умножители, в которых ион, попадая на первый динод , выбивает из него пучок электронов, которые в свою очередь, попадая на следующий динод, выбивают из него ещё большее количество электронов и т. д. Другой вариант - фотоумножители, регистрирующие свечение, возникающее при бомбардировке ионами люминофора. Кроме того, используются микроканальные умножители, системы типа диодных матриц и коллекторы, собирающие все ионы, попавшие в данную точку пространства (коллекторы Фарадея).

Хромато-масс-спектрометрия

Масс-спектрометры используются для анализа органических и неорганических соединений.

Органические вещества в большинстве случаев представляют собой многокомпонентные смеси индивидуальных компонентов. Например, показано, что запах жареной курицы составляют 400 компонентов (то есть, 400 индивидуальных органических соединений). Задача аналитики состоит в том, чтобы определить сколько компонентов составляют органическое вещество, узнать какие это компоненты (идентифицировать их) и узнать сколько каждого соединения содержится в смеси. Для этого идеальным является сочетание хроматографии с масс-спектрометрией. Газовая хроматография как нельзя лучше подходит для сочетания с ионным источником масс-спектрометра с ионизацией электронным ударом или химической ионизацией, поскольку в колонке хроматографа соединения уже находятся в газовой фазе. Приборы, в которых масс-спектрометрический детектор скомбинирован с газовым хроматографом, называются хромато-масс-спектрометрами («Хромасс»).

Многие органические соединения невозможно разделить на компоненты с помощью газовой хроматографии, но можно с помощью жидкостной хроматографии. Для сочетания жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией сегодня используют источники ионизации в электроспрее (ESI) и химической ионизации при атмосферном давлении (APCI), а комбинацию жидкостных хроматографов с масс-спектрометрами называют ЖХ/МС (англ. LC/MS ). Самые мощные системы для органического анализа, востребованные современной протеомикой, строятся на основе сверхпроводящего магнита и работают по принципу ионно-циклотронного резонанса. Они также носят название FT/MS, поскольку в них используется Фурье преобразование сигнала.

Характеристики масс-спектрометров и масс-спектрометрических детекторов

Важнейшими техническими характеристиками масс-спектрометров являются чувствительность, динамический диапазон, разрешение, скорость сканирования.

Важнейшая характеристика при анализе органических соединений - это чувствительность. Для того, чтобы достигнуть как можно большей чувствительности при улучшении отношения сигнала к шуму прибегают к детектированию по отдельным выбранным ионам. Выигрыш в чувствительности и селективности при этом колоссальный, но при использовании приборов низкого разрешения приходится приносить в жертву другой важный параметр - достоверность. Ведь если Вы записывали только один пик из всего характеристического масс-спектра, Вам понадобится ещё много поработать, чтобы доказать, что этот пик соответствует именно тому компоненту, который Вас интересует. Как же разрешить эту проблему? Использовать высокое разрешение на приборах с двойной фокусировкой, где можно добиться высокого уровня достоверности не жертвуя чувствительностью. Или использовать тандемную масс-спектрометрию, когда каждый пик, соответствующий материнскому иону можно подтвердить масс-спектром дочерних ионов. Итак, абсолютным рекордсменом по чувствительности является органический хромато-масс-спектрометр высокого разрешения с двойной фокусировкой.

По характеристике сочетания чувствительности с достоверностью определения компонентов следом за приборами высокого разрешения идут ионные ловушки. Классические квадрупольные приборы нового поколения имеют улучшенные характеристики благодаря ряду инноваций, применённых в них, например, использованию искривлённого квадрупольного префильтра, предотвращающего попадание нейтральных частиц на детектор и, следовательно, снижению шума.

Применения масс-спектрометрии

Разработка новых лекарственных средств для спасения человека от ранее неизлечимых болезней и контроль производства лекарств, генная инженерия и биохимия, протеомика . Без масс-спектрометрии немыслим контроль над незаконным распространением наркотических и психотропных средств, криминалистический и клинический анализ токсичных препаратов, анализ взрывчатых веществ.

Выяснение источника происхождения очень важно для решения целого ряда вопросов: например, определение происхождения взрывчатых веществ помогает найти террористов, наркотиков - бороться с их распространением и перекрывать пути их трафика. Экономическая безопасность страны более надёжна, если таможенные службы могут не только подтверждать анализами в сомнительных случаях страну происхождения товара, но и его соответствие заявленному виду и качеству. А анализ нефти и нефтепродуктов нужен не только для оптимизации процессов переработки нефти или геологам для поиска новых нефтяных полей, но и для того, чтобы определить виновных в разливах нефтяных пятен в океане или на земле.

В эпоху «химизации сельского хозяйства» весьма важным стал вопрос о присутствии следовых количеств применяемых химических средств (например, пестицидов) в пищевых продуктах. В мизерных количествах эти вещества могут нанести непоправимый вред здоровью человека.

Целый ряд техногенных (то есть не существующих в природе, а появившихся в результате индустриальной деятельности человека) веществ являются супертоксикантами (имеющими отравляющее, канцерогенное или вредное для здоровья человека действие в предельно низких концентрациях). Примером является хорошо известный диоксин .

Существование ядерной энергетики немыслимо без масс-спектрометрии. С её помощью определяется степень обогащения расщепляющихся материалов и их чистота.

Конечно и медицина не обходится без масс-спектрометрии. Изотопная масс-спектрометрия углеродных атомов применяется для прямой медицинской диагностики инфицированности человека Helicobacter pylori и является самым надёжным из всех методов диагностики. Также, масс-спектрометрия применяется для определения наличия допинга в крови спортсменов.

Трудно представить область человеческой деятельности, где не нашлось бы места масс-спектрометрии. Ограничимся просто перечислением: аналитическая химия , биохимия , клиническая химия , общая химия и органическая химия , фармацевтика , косметика , парфюмерия , пищевая промышленность , химический синтез , нефтехимия и нефтепераработка, контроль окружающей среды, производство полимеров и пластиков, медицина и токсикология , криминалистика , допинговый контроль, контроль наркотических средств, контроль алкогольных напитков, геохимия , геология , гидрология , петрография , минералогия , геохронология , археология , ядерная промышленность и энергетика , полупроводниковая промышленность , металлургия .

Примечания

См. также

• Масс-спектрометры для элементного анализа
• Лазерно-искровая масс-спектрометрия (Лазерная микромасс-спектрометрия)
• Хромато-масс-спектрометр
• Системы ВЭЖХ-масс-спектрометр
• Жидкостная хроматография ; Колонки для ВЭЖХ

Ссылки

• Масс-спектрометрия (англ.)

Wikimedia Foundation . 2010 .

Применение масс-спектрометрии

• · Ядерная энергетика;
• · Археология;
• · Нефтехимия;
• · Геохимия (изотопная геохронология);
• · Агрохимия;
• · Химическая промышленность;
• · Анализ полупроводниковых материалов, особо чистых металлов, тонких пленок и порошков (например, оксидов U и РЗЭ);
• · Фармацевтика - для контроля качества производимых лекарств и выявления фальсификатов;
• · Медицинская диагностика;
• · Биохимия - идентификация белков, исследование метаболизма лекарственных средств.

Хромато-масс-спектрометрия

Хромато-масс-спектрометрия - метод анализа смесей главным образом органических веществ и определения следовых количеств веществв объеме жидкости. Метод основан на комбинации двух самостоятельных методов - хроматографии и масс-спектрометрии. С помощью первого осуществляют разделение смеси на компоненты, с помощью второго - идентификацию и определение строения вещества, количественный анализ. Известны 2 варианта хромато-масс-спектрометрии, представляющие собой комбинацию масс-спектрометрии либо с газо-жидкостной хроматографией (ГЖХ), либо с высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Рис. 10.

Первые исследования аналитических возможностей хромато-масс-спектрометрии были проведены в 1950-х гг., первые промышленные приборы, объединяющие газо-жидкостной хроматограф и

масс-спектрометр, появились в 60-х гг. Принципиальная совместимость этих двух приборов обусловлена тем, что в обоих случаях анализируемое вещество находится в газовой фазе, рабочие температурные интервалы одинаковы, пределы обнаружения (чувствительность) близки. Различие состоит в том, что в ионном источнике масс-спектрометра поддерживается высокий вакуум (10 -5 - 10 -6 Па), тогда как давление в хроматографической колонке 10 5 Па. Для понижения давления используют сепаратор, который одним концом соединен с выходом хроматографической колонки, а другим - с ионным источником масс-спектрометра. Сепаратор удаляет из газового потока, выходящего из колонки, основную часть газа-носителя, а органическое вещество пропускает в масс-спектрометр. При этом давление на выходе колонки понижается до рабочего давления в масс-спектрометре.

Принцип действия сепараторов основан либо на различии подвижности молекул газа-носителя и анализируемого вещества, либо на их различной проницаемости через полупроницаемую мембрану. В промышленности чаще всего применяют инжекторные сепараторы, работающие по первому принципу. Одностадийные сепараторы этого типа содержат две форсунки с отверстиями небольшого диаметра, которые установлены точно напротив друг друга. В объеме между форсунками создается давление 1,33 Па. Газовый поток из хроматографической колонки через первую форсунку со сверхзвуковой скоростью попадает в область вакуума, где молекулы распространяются со скоростями, обратно пропорциональными их массе. В результате более легкие и быстрые молекулы газа-носителя откачиваются насосом, а более медленные молекулы органического веществава попадают в отверстие второй форсунки, а затем в ионный источник масс-спектрометра. Некоторые приборы снабжены двухстадийным сепаратором, снабженным еще одним подобным блоком форсунок. В объеме между ними создается высокий вакуум. Чем легче молекулы газа-носителя, тем эффективнее они удаляются из газового потока и тем выше обогащение органическим веществом.

Наиболее удобный для хромато-масс-спектрометрии газ-носитель - гелий. Эффективность работы сепаратора, т.е. отношение количества органического вещества в газовом потоке, выходящем из колонки, к его количеству, поступающему в масс-спектрометр, в значительной степени зависит от расхода газа-носителя, попадающего в сепаратор. При оптимальном расходе 20-30 мл/мин удаляется до 93% газа-носителя, а в масс-спектрометр поступает более 60% анализируемого вещества. Такой расход газа-носителя типичен для насадочных колонок. В случае использования капиллярной хроматографической колонки расход газа-носителя не превышает 2-3 мл/мин, поэтому на ее выходе в газовый поток добавляют дополнительное количество газа-носителя, чтобы скорость потока, поступающего в сепаратор, достигла 20-30 мл/мин. Тем самым обеспечивается наилучшая эффективность сепаратора. Гибкие кварцевые капиллярные колонки могут вводиться непосредственно в ионный источник. В этом случае ионный источник должен быть обеспечен мощной откачивающей системой, поддерживающей высокий вакуум.

В масс-спектрометрах, соединенных с газовыми хроматографами, применяется ионизация электронным ударом, химическая или полевая. Хроматографические колонки должны содержать труднолетучие и термостабильные стационарные жидкие фазы, чтобы масс-спектр их паров не налагался на спектр анализируемого вещества.

Анализируемое вещество (обычно в растворе) вводится в испаритель хроматографа, где мгновенно испаряется, а пары в смеси с газом-носителем под давлением поступают в колонку. Здесь происходит разделение смеси, и каждый компонент в токе газа-носителя по мере элюирования из колонки поступает в сепаратор. В сепараторе газ-носитель в основном удаляется и обогащенный органическим веществом газовый поток поступает в ионный источник масс-спектрометра, где молекулы ионизируются. Число образующихся при этом ионов пропорционально количеству поступающего вещества. С помощью установленного в масс-спектрометре датчика, реагирующего на изменение полного ионного тока, записывают хроматограммы. Таким образом, масс-спектрометр можно рассматривать как универсальный детектор к хроматографу. Одновременно с записью хроматограммы в любой ее точке, обычно на вершине хроматографического пика, может быть зарегистрирован масс-спектр, позволяющий установить строение вещества.

Важное условие работы прибора - быстрая запись масс-спектра, который должен регистрироваться за время, гораздо меньшее, чем время выхода хроматографического пика. Медленная запись масс-спектра может исказить соотношение интенсивностей пиков в нем. Скорость регистрации масс-спектра (скорость сканирования) определяется масс-анализатором. Наименьшее время сканирования полного масс-спектра (несколько миллисекунд) обеспечивает квадрупольный анализатор. В современных масс-спектрометрах, снабженных ЭВМ, построение хроматограмм и обработка масс-спектров производится автоматически. Через равные промежутки времени по мере элюирования компонентов смеси регистрируются масс-спектры, количественные характеристики которых накапливаются в памяти ЭВМ. Для каждого сканирования производится сложение интенсивностей всех регистрируемых ионов. Так как эта суммарная величина (полный ионный ток) пропорциональна концентрации вещества в ионном источнике, то ее используют для построения хроматограммы (эта величина откладывается по оси ординат, по оси абсцисс - время удерживания и номер сканирования). Задавая номер сканирования, можно вызвать из памяти масс-спектр в любой точке хроматограммы.

Как описано выше, могут быть проанализированы смеси веществ, достаточно хорошо разделяемые на подходящих колонках хромато-масс-спектрометрии. Иногда удается исследовать и неразрешенные хроматографические пики. Исследуемые вещества должны быть термически стабильны, хроматографически подвижны в интервале рабочей температуры колонки, легко переводиться в паровую фазу при температуре испарителя. Если вещества не удовлетворяют этим требованиям, их можно химически модифицировать, например силилированием, алкилированием или ацилированием гидрокси-, карбокси-, меркапто-, аминогрупп.

Чувствительность хромато-масс-спектрометрии (обычно 10 -6 -10 -9 г) определяется чувствительностью детектора масс-спектрометра. Более чувствительна (10 -12 -10 -15 г) разновидность хромато-масс-спектрометрии - масс-фрагментография, называемая также селективным ионным или многоионным детектированием. Суть ее состоит в том, что запись хроматограмм осуществляется не по полному ионному току, а по наиболее характерным для данного вещества ионам. Этот вид хромато-масс-спектрометрии используют для поиска, идентификации и количественного анализа вещества с известным масс-спектром в составе сложной смеси, например при количественном определении следов веществ в больших объемах биологических жидкостей (медицина, фармакология, токсикология, допинг-контроль, биохимия). Осуществляют масс-фрагментографию на хромато-масс-спектрометрах с использованием специального устройства - многоионного детектора либо с помощью ЭВМ, которая может строить хроматограммы по одному или нескольким ионам. Такая хроматограмма, в отличие от обычной, содержит пики лишь тех компонентов, в масс-спектрах которых есть такие ионы. Анализ проводят с применением внутреннего стандарта, в качестве которого часто используют аналог искомого вещества, меченный стабильными изотопами (2 Н, 13 С, 15 N, 18 O).

Другой вариант хромато-масс-спектрометрии заключается в сочетании высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Метод предназначен для анализа смесей труднолетучих, полярных веществ, не поддающихся анализу методом ГЖ хромато-масс-спектрометрии. Для сохранения вакуума в ионном источнике масс-спектрометра необходимо удалять растворитель, поступающий из хроматографа со скоростью 0,5-5 мл/мин. Для этого часть жидкого потока пропускают через отверстие в несколько мкм, в результате чего образуются капли, которые далее попадают в обогреваемую зону, где большая часть растворителя испаряется, а оставшаяся вместе с веществом попадает в ионный источник и ионизируется химически.

В ряде промышленных приборов реализован принцип ленточного транспортера. Элюат из колонки попадает на движущуюся ленту, которая проходит через обогреваемую ИК излучением камеру, где испаряется растворитель. Затем лента с веществом проходит через область, обогреваемую другим нагревателем, где испаряется анализируемое вещество, после чего оно поступает в ионный источник и ионизируется. Более эффективный способ сочетания высокоэффективного газо-жидкостного хроматографа и масс-спектрометра основан на электро- и термораспылении. В этом случае элюат пропускают через капилляр, нагретый до 150 °С, и распыляют в вакуумную камеру. Ионы буфера, присутствующие в растворе, участвуют в ионообразовании. Образовавшиеся капли несут положительный, или отрицательный заряд. Вдоль капли из-за малого ее диаметра создается высокий градиент электрического поля, причем по мере распада капель этот градиент возрастает. При этом происходит десорбция из капель протонированных ионов или кластеров (молекула вещества + катион буфера).

Метод хромато-масс-спектрометрии используют при структурно-аналитических исследованиях в органической химии, нефтехимии, биохимии, медицине, фармакологии, для охраны окружающей среды и др.

Данный метод принципиально отличается от рассмотренных выше спектроскопических методов. Структурная масс-спектрометрия основана на разрушении органической молекулы в результате ионизации тем или иным способом.

Образующиеся ионы сортируются по величинам их отношения масса/заряд (m/z), затем регистрируется число ионов для каждого значения этого отношения в виде спектра. На рис. 5.1. представлена общая схема типичного масс-спектрометра.

Рис. 5.1. Блок-схема типичного масс-спектрометра

Для ведения пробы в масс-спектрометр обычно применяют какой-либо вид хроматографии, хотя во многих приборах есть возможность для прямого ввода образца в ионизационную камеру. Во всех масс-спектрометрах имеются устройства для ионизации пробы и разделения ионов по величине m/z. После разделения нужно детектировать ионы и измерять их количество. Типичный коллектор ионов состоит из коллимирующих щелей, которые направляют в коллектор в данный момент только ионы одного вида, где они детектируются, а сигнал детектирования усиливается электронным умножителем. Современные масс-спектрометры укомплектованы специализированным программным обеспечением: компьютеры контролируют накопление, хранение и визуализацию данных.

В настоящее время стала обычной практика объединения масс-спектрометра с газовым (ГХ-МС) или жидкостным (ЖХ-МС) хроматографом.

Все масс-спектрометры подразделяются на два класса: приборы низкого (единичного) и высокого разрешения (R). Спектрометры низкого разрешения – приборы, на которых можно разделить целые массы до m/z 3000 (R = 3000/(3000-2990) = 3000). На таком приборе соединения C 16 H 26 O 2 и С 15 Н 24 NO 2 неразличимы, поскольку прибор будет фиксировать и в первом и во втором случае массу 250.

Приборы высокого разрешения (R = 20000) смогут различить соединения C 16 H 26 O 2 (250.1933) и С 15 Н 24 NO 2 (250.1807), в этом случае R = 250.1933/(250.1933 – 250.1807) = 19857.

Таким образом, на приборах низкого разрешения можно устанавливать структурную формулу вещества, однако зачастую для этой цели дополнительно необходимо привлекать данные других методов анализа (ИК-, ЯМР-спектроскопия).

Приборы высокого разрешения могут измерять массу иона с точностью, достаточной для определения атомного состава, т.е. определять молекулярную формулу исследуемого вещества.

В последнее десятилетие происходило быстрое развитие и совершенствование масс-спектрометров. Не обсуждая их устройство, отметим, что они подразделяются по типам в зависимости от 1) способа ионизации, 2) метода разделения ионов. В общем, способ ионизации не зависит от метода разделения ионов и наоборот, хотя имеются исключения. Более полная информация по данным вопросам изложена в литературе [Сайнсб. Лебедев].

В данном пособии будут рассмотрены масс-спектры, полученные ионизацией электронным ударом.

5.2. Масс-спектры с ионизацией электронным ударом

Электронный удар (ЭУ, electron impact, EI) – наиболее распространенный метод ионизации в масс-спектрометрии. Преимуществом этого метода является возможность использования поисковых систем и баз данных (метод ЭУ был исторически первым методом ионизации, основные базы экспериментальных данных получены на приборах с ЭУ).

Молекула вещества пробы в газовой фазе подвергается бомбардировке электронов с высокой энергией (обычно 70 эВ) и выбрасывает электрон, образуя катион-радикал, называемый молекулярным ионом :

М + e → М + (молекулярный ион) + 2e

Наименьшая энергия бомбардирующих (ионизующих) электронов, при которой возможно образование из данной молекулы иона, называется энергией (или, менее удачно, «потенциалом») ионизации вещества (U e).

Энергия ионизации является мерой прочности, с какой молекула удерживает наименее сильно связанный с ней электрон.

Как правило, для органических молекул энергия ионизации составляет 9-12 эВ, поэтому бомбардировка электронами с энергией 50 эВ и выше сообщает избыточную внутреннюю энергию возникающему молекулярному иону. Эта энергия частично рассеивается за счет разрыва ковалентных связей.

В результате такого разрыва происходит распад молекулярного иона на частицы меньшей массы (фрагменты). Такой процесс называется фрагментацией .

Фрагментация происходит избирательно, является высоковоспроизводимой и характеристичной для данного соединения . Более того, процессы фрагментации предсказуемы, и именно они обуславливают широкие возможности масс-спектрометрии для структурного анализа. По-сути, структурный анализ методом масс-спектрометрии заключается в идентификации осколочных ионов и ретроспективном восстановлении структуры исходной молекулы, исходя из направлений фрагментации молекулярного иона. Так, например, метанол образует молекулярный ион по схеме:

О
дна точка – оставшийся нечетный электрон; когда заряд локализован на отдельном атоме, знак заряда указывается на этом атоме.

Многие из этих молекулярных ионов распадаются за время 10 -10 – 10 -3 с и дают ряд осколочных ионов (первичная фрагментация):

Если некоторые из молекулярных ионов имеют достаточно большое время жизни, то они достигают детектора и регистрируются в виде пика молекулярного иона. Поскольку заряд исходного иона равен единице, отношение m / z для этого пика дает молекулярную массу исследуемого вещества.

Таким образом, масс-спектр – это представление относительных концентраций положительно заряженных осколков (включая молекулярный ион) в зависимости от их масс .

В специальной литературе приводятся таблицы наиболее часто встречающихся фрагментных ионов, где указана структурная формула иона и его значение m/z [Преч, Гордон, Сильверстейн].

Высота наиболее интенсивного в спектре пика принимается за 100%, а интенсивности других пиков, включая пик молекулярного иона, выражаются в процентах от максимального пика.

В определенных случаях самым интенсивным может быть и пик молекулярного иона. В общем случае: интенсивность пика зависит от устойчивости образующегося иона .

В масс-спектрах часто присутствует серия пиков фрагментных ионов, различающихся на гомологическую разность (СН 2), т.е. 14 а.е.м. Гомологические серии ионов характерны для каждого класса органических веществ, а потому они несут важную информацию о структуре исследуемого вещества.