Особенности проведения прямой пробы кумбса и расшифровка полученных результатов. Реакция Кумбса непрямая (антиглобулиновый тест, выявление неполных антиэритроцитарных антител), кровь

Принцип антиглобулинового . Антиэритроцитные антитела неполного типа и молекулы комплемента (С), находящиеся на поверхности эритроцитов выявимы - прямой тест - их агглютинацией в контакте с животной сывороткой, содержащей антитела на человеческий антиглобулин (антиглобулиновая сыворотка). Свободные в сыворотке неполные антитела выявляются - косвенный тест - их закреплением на смеси нормальных эритроцитов группы 0, все антигены которых принадлежат известной резус-системе, далее агглютинируемые под воздействием антиглобулиновой сыворотки.

Материалы, реагенты антиглобулинового теста Кумбса : пробирки на 10/100 мл; градуированные пипетки на 1, 2 мл; пастеровские пипетки; штативы; предметные нешлифованные стекла; 8,5‰ раствор NaCl; эритроциты. Эритроциты больного, равно как и принадлежащие к группе 0 получим из свежеотобранной крови на противосвертывающем веществе (раствор ЭДТА).

Эритроциты группы 0 отобрать с таким расчетом, чтобы они исходили от лиц в норме и содержали все антигены резус-системы . Их можно сохранять до 7 дней в аутологической плазме, при температуре + 4°С. В случае отсутствия эритроцитов группы 0, известной антигенной мозаики, можно использовать смесь эритроцитов группы 0, резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов.

Сыворотка больного должна быть свежеотобранной.

Антиглобулиновая сыворотка производится институтом им. д-ра И. Кантакузино, выпускается в лиофилизированном виде в содержащих 1 мл ампулах. После растворения сыворотку хранить при температуре -20°С.

Техника антиглобулинового теста Кумбса :
а) Прямой тест Кумбса : эритроциты больного промыть 3 раза 8,5‰ раствором NaCl.
На несколько предметных стекол нанести по крупной капле из разведений антиглобулиновой сыворотки, а рядом - по маленькой капле из осадка эритроцитов больного; перемешать капли углом стекла. Приготовленный материал оставить на столе 5 мин., затем исследовать на наличие агглютинатов. В случае положительного результата определить максимальный агглютинирующий титр.

б) Косвенный тест Кумбса : эритроциты группы 0, резусположительные и резус-отрицательные промыть 3 раза 8,5‰ раствором NaCl и подвергнуть воздействию сыворотки больного из расчета 2 капли эритроцитов на 8-10 капель сыворотки, затем, в течение 60 мин., провести инкубацию при температуре 37°С. После этого снова трижды промыть эритроциты и воздействовать на них антиглобулиновой сывороткой, по указаниям для прямого теста Кумбса.

Когда речь идет о холодовых активных антителах сенсибилизацию эритроцитов группы 0 провести 60 мин. при температуре + 4°С.

Примечание : 1) Не проводить прямой тест Кумбса на эритроцитах, сохраненных один или несколько дней при температуре + 4°С или комнатной температуре, поскольку результаты могут оказаться ложноположительными за счет фиксации имеющихся в нормальной сыворотке непол ных, активных на холоде антител. 2) В случаях выраженной гиперпротеинемии промывать эритроциты 4-5 раз и проверить отсутствие сывороточных белков в последней промывной жидкости, с помощью сулфосалициловой кислоты.

Возможный остаток 2 мкг IgG/мл в эритроцитном осадке может нейтрализовать антиглобулиновую сыворотку . Тест Кумбса можно проводить и с помощью моноспецифических анти-IgG, -IgM, -IgA -С3 и -С4 сывороток в целях уточнения вида, находящихся на поверхности эритроцитов глуболин, например, у страдающих аутоиммунной гемолитической анемией.

Гемолитическая болезнь новорожденных обычно развивается при несовместимости матери и плода по антигенам систем Rh и AB0, гораздо реже — по антигенам систем Келл, Даффи и MNSs.

1. Гемолитическая болезнь новорожденных, вызванная несовместимостью по антигенам системы Rh . Выработка антител к антигенам системы Rh (в отличие от антител к антигенам системы AB0) происходит только при попадании этого антигена в кровь матери. При нормально протекающей беременности количество эритроцитов плода, проникающих в кровь матери, слишком мало, и иммунизация не происходит. Достаточное для иммунизации количество крови плода может попасть в кровь матери в третьем периоде родов. При первой беременности гемолитическая болезнь новорожденных, вызванная несовместимостью по антигенам системы Rh , возникает только в тех случаях, когда матери раньше переливали кровь, несовместимую по антигенам системы Rh , или она была иммунизирована при амниоцентезе. В отличие от этого, при несовместимости по антигенам системы AB0 гемолитическая болезнь новорожденных может возникнуть даже во время первой беременности, потому что антитела к этим антигенам постоянно присутствуют в крови матери. Чаще всего при гемолитической болезни новорожденных, обусловленной несовместимостью по антигенам системы Rh , вырабатываются антитела к D-антигену. Этот антиген отсутствует примерно у 15% белых и 7% негров. Среди других антигенов системы Rh , которые могут вызвать гемолитическую болезнь новорожденных, можно отметить антигены c и E.

а. Клиническая картина. У плода развивается гемолитическая анемия, которая в тяжелых случаях приводит к сердечной недостаточности, водянке и гибели. Гипербилирубинемия у плода не возникает, так как билирубин свободно проникает через плаценту и попадает в кровь матери. У новорожденного, напротив, наибольшую опасность представляет гипербилирубинемия, поскольку она может привести к билирубиновой энцефалопатии. Иногда наблюдается гепатоспленомегалия. Дифференциальную диагностику проводят с гепатитом, инфекциями, болезнями обмена веществ и геморрагической болезнью новорожденных.

б. Диагностика

1) На ранних сроках беременности определяют групповую (по системам AB0 и Rh ) принадлежность крови беременной и исследуют ее сыворотку на антитела к редким антигенам эритроцитов. Если мать Rh -отрицательна, определяют Rh -принадлежность отца ребенка. Во время беременности регулярно определяют титр антирезусных антител.

2) При появлении антирезусных антител оценивают интенсивность гемолиза. Для этого проводят спектрофотометрический анализ околоплодных вод, полученных при амниоцентезе.

3) При несовместимости по антигенам системы Rh сразу после рождения определяют уровни гемоглобина и билирубина в пуповинной крови.

4) Проводят прямую пробу Кумбса с эритроцитами новорожденного. При положительной пробе определяют, к каким эритроцитарным антигенам направлены антитела. Если в материнской крови антитела к этим антигенам отсутствуют, выясняют, почему прямая проба Кумбса положительна.

в. Лечение во внутриутробном периоде. Раннее интенсивное лечение позволяет снизить риск осложнений.

1) Если титр антирезусных антител у матери превышает 1:8, проводят амниоцентез. Для косвенного определения уровня билирубина и оценки тяжести гемолиза измеряют оптическую плотность околоплодных вод при длине волны 450 нм.

2) Высокая оптическая плотность околоплодных вод в середине и конце беременности свидетельствует о тяжелом гемолизе у плода. В этом случае необходимо провести общий анализ крови плода. Ее получают при кордоцентезе. Снижение гематокрита до 18% и менее служит показанием для внутриутробного переливания эритроцитарной массы Rh -отрицательной крови группы 0. При необходимости переливание эритроцитарной массы повторяют каждые 2—3 нед. Повторные переливания эритроцитарной массы могут частично или полностью подавить эритропоэз у плода.

3) Если развитие плода соответствует гестационному возрасту, на 33—36-й неделе беременности проводят кесарево сечение.

4) Сразу после рождения ребенка определяют его группу крови и проводят прямую пробу Кумбса. После внутриутробного переливания эритроцитарной массы кровь новорожденного может стать Rh -отрицательной.

5) Если прямая проба Кумбса у новорожденного положительна, может потребоваться обменное переливание крови.

г. Лечение новорожденного. При гипербилирубинемии применяют светолечение и обменное переливание крови.

1) Для светолечения используют синий свет, который способствует превращению билирубина в водорастворимые продукты. Светолечение используют в дополнение к обменному переливанию крови — до и после него. Светолечение не должно заменять диагностических мероприятий, направленных на выяснение причин желтухи. Во время светолечения необходимо регулярно определять уровень билирубина в сыворотке, поскольку интенсивность желтухи у новорожденных не соответствует тяжести гемолиза. Чтобы предупредить повреждение сетчатки во время светолечения, глаза ребенка закрывают повязкой.

2) Обменное переливание крови

а) Водянка плода. Проводят обменное переливание крови с однократным замещением ОЦК или переливают эритроцитарную массу.

б) Уровень билирубина более 20 мг% у доношенных и 12—16 мг% у недоношенных — проводят обменное переливание крови с двукратным замещением ОЦК .

3) При анемии (уровень гемоглобина ниже 7—10 г%) после внутриутробного или обменного переливания крови может потребоваться переливание эритроцитарной массы. Эритроциты, покрытые антирезусными антителами, иногда разрушаются медленно, что может привести к анемии в отсутствие гипербилирубинемии через 3—6 нед после рождения.

4) Пассивная иммунизация матери. Риск иммунизации антигенами системы Rh существенно снижается, если Rh -отрицательной матери вводят анти-Rh 0 (D)-иммуноглобулин. Первый раз его назначают в конце II триместра беременности, второй — в первые 72 ч после рождения Rh -положительного ребенка. Анти-Rh 0 (D)-иммуноглобулин необходимо вводить также после аборта и амниоцентеза. Одна ампула анти-Rh 0 (D)-иммуноглобулина (300 мкг) нейтрализует около 15 мл Rh -положительной крови. При подозрении на попадание в кровь матери большего объема крови плода делают мазок по Клейхауэр—Бетке (для выявления эритроцитов плода в крови матери) и вводят соответствующую дозу анти-Rh 0 (D)-иммуноглобулина.

2. Гемолитическая болезнь новорожденных, вызванная несовместимостью по антигенам системы AB0, обычно встречается у детей с группой крови A или B, рожденных матерями с группой крови 0. В сыворотке матери с группой крови 0 присутствуют изогемагглютинины к эритроцитарным антигенам A и B. Предсказать развитие гемолитической болезни новорожденного по титру этих антител у матери нельзя.

а. Клиническая картина. Гемолитическая болезнь может возникнуть даже у ребенка, рожденного от первой беременности. У доношенных тяжелая анемия и водянка встречаются редко. Иногда в первые сутки жизни появляется желтуха, однако гемолиз выражен значительно слабее, чем при несовместимости по антигенам системы Rh .

в. Лечение направлено на снижение гипербилирубинемии. Светолечение снижает потребность в обменном переливании крови, которое в настоящее время проводят лишь у 1 из 3000 новорожденных с гемолитической болезнью, вызванной несовместимостью по антигенам системы AB0. Если необходимо переливание крови, используют эритроцитарную массу группы 0 с низким титром антител к антигенам A и B.

КУМБСА РЕАКЦИЯ (R. R. А. Coombs, англ. иммунолог, род. в 1921 г.; син.: проба Кумбса, антиглобулиновый тест ) - иммунологическая реакция для выявления неполных антител к ауто- и изоантигенам эритроцитов.

Реакция была разработана в 1908 г. Мореши (С. Moreschi), но получила широкое применение лишь с 1945 г. после того, как Кумбсом была показана ее роль в определении совместимости при гемотрансфузиях, резус-конфликте, диагностике аутоаллергических и аутоиммунных состояний и др.

К. р. основана на использовании в ней специально приготовленного препарата - антиглобулиновой сыворотки. В присутствии антиглобулиновой сыворотки эритроциты, нагруженные неполными антителами, агглютинируются. Эритроциты, не содержащие на своей поверхности антител, остаются неагглютинированными.

К. р. широко применяется для: а) установления состояния изосенсибилизации, т. е. обнаружения изоантител, возникающих при повторных переливаниях крови (см. Переливание крови) или беременностях (см. Беременность); б) выполнения пробы на совместимость при гемо-трансфузиях; в) определения в эритроцитах разновидности резус-фактора (см.); г) обнаружения аутоиммунных антител на эритроцитах больных приобретенной гемолитической анемией (см.) и другими аутоаллергическими болезнями (см.), а также при некоторых инфекциях, протекающих с аллергическим компонентом; д) обнаружения изоиммунных антител, фиксированных на эритроцитах детей, страдающих гемолитической болезнью новорожденных (см.). К. р. применяется также в судебно-медицинских и антропологических исследованиях.

Основным материалом для постановки К. р. являются сыворотка или цитратная плазма и эритроциты, больного. Различают два варианта К. р.: непрямую и прямую. При непрямой К. р. изучают сыворотку больного, в к-рой определяют свободно циркулирующие антитела. При прямой К. р. исследуют эритроциты на присутствие антител, фиксированных на этих форменных элементах крови.

Антиглобулиновую сыворотку для К. р. получают путем иммунизации лаб. животных (кроликов, коз, овец и др.) глобулинами, выделенными из сыворотки человека фракционированием этанолом, сернокислым аммонием или гель-фильтрацией на сефадексе. При получении антиглобулиновой сыворотки необходимо удалить гетероагглютинирующие антитела, возникающие в результате иммунизации животных глобулинами человека. Достигают этого путем адсорбции иммунной сыворотки смесью эритроцитов людей с различной группой крови или разведением ее изотоническим р-ром хлорида натрия. В последнем случае титр гетеро-агглютининов должен быть невысок (1: 16 - 1: 32), с тем чтобы антиглобулиновая сыворотка после разведения сохранила хорошую активность в К. р.

Непрямая Кумбса реакция

Непрямая Кумбса реакция проводится в два этапа. Первый этап выполняют в специально предназначенных для этой цели небольших пробирках размером 4 X 0,5 см. В каждую пробирку к трем каплям сыворотки (цельная, 1: 2 и т. д.), в к-рой подозревают наличие антител, добавляют одну каплю осадка эритроцитов известного антигенного состава. Содержимое пробирки перемешивают и помещают в термостат при t° 37° на 1 час. Затем эритроциты троекратно отмывают изотоническим р-ром хлорида натрия. Второй этап состоит в приготовлении 5% взвеси отмытых эритроцитов и соединении на белой (фарфоровой) пластинке со смачиваемой поверхностью одной капли эритроцитов с одной каплей антиглобулиновой сыворотки. Учет результатов выполняют до 10 мин. Исключение ложноположительных результатов производят путем выполнения контрольных исследований. Использование изотонического р-ра хлорида натрия вместо антиглобулиновой сыворотки не должно сопровождаться агглютинацией эритроцитов. Выполнение непрямой К. р. в отношении эритроцитов известного фенотипа изоантигенов позволяет установить специфичность антител. Напр., исследование сыворотки больного с эритроцитами 0(I), CDE, Kk, Fya; 0(1), CDe, Kk, Fуа; 0(I), сDe, Кк, Fya; 0(I), cDE, Кк, Fya; 0(I), cde, kk, Fya показало положительный результат с образцом крови в 1-м и 4-м случаях; другие образцы крови (2, 3, 5-й случаи) показали отрицательный результат. Сыворотка содержит анти-Е-антитела. С помощью непрямой К. р. могут быть выявлены неполные антитела против антигенов: С, D, Е, с, е; К, k; Fya, Fyb; Lea, Leb; Jka, Jkb и др. (см. Группы крови).

Прямая Кумбса реакция

Прямая Кумбса реакция по технике выполнения соответствует второму этапу непрямой К. р.: троекратно отмытые изотоническим р-ром хлорида натрия исследуемые эритроциты больного (5% взвесь) соединяют с антиглобулиновой сывороткой. Прямую К. р. выполняют, когда есть основание полагать, что эритроциты исследуемого больного in vivo уже сенсибилизированы антителами. Положительная прямая К. р. служит диагиостическим признаком при гемолитической болезни новорожденных, обусловленной сенсибилизацией организма женщины к антигенам плода и проникновением антител через плаценту в организм ребенка, а также при приобретенной гемолитической анемии.

За последние годы К. р. существенно усовершенствована. С ее помощью удается не только констатировать наличие на эритроцитах антител, но и установить класс иммуноглобулинов (см.). Для этого используют сыворотку против отдельных классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA. Изоиммунные антитела против резус, Келл-антигенов, Даффи-антигенов и других антигенов, а также тепловые аутоиммунные антитела, как правило, относятся к IgG. Холодовые аутоиммунные антитела, а также изоиммунные антитела против Le и некоторых других антигенов, как правило, относятся к IgM. Природу IgA имеют лишь редко встречающиеся аутоиммунные антитела (см. Аутоантитела) .

Библиография: Дыгин В. П. Аутоиммунные заболевания в клинике внутренних болезней, Л., 1970, библиогр.; Кассир-с к и й И. А. и Алексеев Г. А. Клиническая гематология, М., 1970; Косяков П. Н. Изо антигены и изо антитела человека в норме и патологии, М., 1974, библиогр.; В о i v i n P. e. a. Les anemies hemolytiques, p. 93, P., 1971, bibliogr.; Clinical aspects of immunology, ed. by P. G. H. Geli а. о., Oxford, 1975; Coombs R. R. A., M o u г a n t A. E. a. Race R. R. In-vivo isosensitisation of red cells in babies with haemolytic disease, Lancet, v. 1, p. 264, 1946.

В норме антитела к эритроцитам в крови отсутствуют.

Прямая проба Кумбса - антиглобулиновый тест (агглютинация в геле, позволяет выявить полные двухвалентные антитела), с помощью которого определяют антитела класса IgG и С3-компонент комплемента на поверхности эритроцитов. Обычно антитела, выявляемые прямой пробой Кумбса, имеют широкую специфичность, не ассоциированную с хорошо установленным антигеном. Положительная прямая проба Кумбса чётко указывает на наличие у больного гемолитической анемии, хотя не все больные с положительным прямым антиглобулиновым тестом страдают этим заболеванием. Приблизительно у 10% больных антитела или компоненты комплемента на мембране эритроцитов не удаётся определить прямой пробой Кумбса (тест отрицательный), но тем не менее они страдают аутоиммунной гемолитической анемией. Для уточнения специфичности антител в таких случаях используют тесты с их элюцией. Прямая проба Кумбса, положительная только к комплементу, обычно имеет отношение к холодовым антителам типа IgM. В этом случае антитела IgM не присутствуют на эритроцитах при базальной температуре тела. Однако вследствие того, что антитела IgM активно фиксируют комплемент, и комплемент остаётся на эритроцитах, при данной форме аутоиммунной гемолитической анемии (болезнь холодовых аггютининов) проба Кумбса будет положительна только к комплементу.

Прямая проба Кумбса положительна при аутоиммунной гемолитической анемии, вызываемой тепловыми антителами, аутоиммунной лекарственной анемии (при приёме метилдофа до 20% больных имеют положительную реакцию), лекарственно-адсорбционном типе гемолитической анемии, иммунокомплексном типе гемолитической анемии (проба положительна только по отношению С3), при аутоиммунной гемолитической анемии, вызываемой холодовыми антителами - болезни холодовых агглютининов (проба положительна только по отношению С3). При пароксизмальной холодовой гемоглобинурии прямая проба Кумбса отрицательная.

Непрямая проба Кумбса - непрямой антиглобулиновый тест (обнаруживает неполные антитела) позволяет выявить атипичные антитела в крови, в том числе аллоантитела, к чужим антигенам эритроцитов. Свое название (непрямая) она получила вследствие того, что протекает в 2 этапа. Первоначально сыворотка крови больного, содержащая неполные антитела, взаимодействует с добавленным корпускулярным Аг-диагностикумом без видимых проявлений. На втором этапе внесённая антиглобулиновая сыворотка взаимодействует с неполными антителами, адсорбированными на антигенах, с появлением видимого осадка. Переливание гомологичных (аллогенных) эритроцитов или беременность - наиболее частые причины образования этих антиэритроцитарных антител. Сочетание положительной непрямой пробы Кумбса с отрицательной прямой пробой ничего не даёт для диагностики аутоиммунной гемолитической анемии. Положительная непрямая проба Кумбса вызывает определённые трудности при подборе крови для переливания и проведении перекрёстной пробы на совместимость с консервированной кровью, но не имеет другого диагностического значения.